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侵袭小室实验

已有 1124 次阅读2016-4-27 17:08

实验原理
Transwell小室底层的一张有通透性的膜（一般为聚碳酸酯膜），将其放置于孔板中，小室内称上室，培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

实验步骤
实验共分以下4个主要步骤：

1. 质粒转染细胞：
准备细胞，转染前一天按照70-80%密度铺在6cm培养皿中。16h后，按照转染试剂说明书转染细胞

2. Transwell铺板：
1) 转染12h后，胰酶消化，收集细胞：细胞计数后，每个样品准备1×106 cells/ml。
2) 1,200rpm离心5min后，重悬浮于1ml无血清培养基。
3) 湿润小室：将300μl预热的无血清培养基加入到小室中，常温放置1~2h，将ECM膜湿润。
4) 将小室中的培养基去掉，24孔板中，没有小室的孔中加入500μl含10%血清的培养基。
5) 用镊子将小室轻轻放入预先加好培养基的孔中，尽量避免产生气泡。
6) 每个样品取300μl，加入到小室中，即3×105 cells加入到小室中，37℃，5% CO2培养箱中培养。
3. 细胞培养及染色：
1) 培养箱中培养72h后，取出小室。
2) 用棉棒将小室内的细胞和培养基去掉。
3) 24孔板中，没有小室的孔中滴入15滴染色液（约500μl）。
4) 用镊子将小室轻轻放入预先加好染色液的孔中，尽量避免产生气泡。
5) 常温放置20min，进行染色。
6) 用去离子水洗3-5次，将背景洗掉。
7) 小室内边缘残留的细胞会影响实验结果，用棉棒擦干。
4. 统计分析：
显微镜下拍照，使用Image-Pro Plus软件进行细胞计数。