芳香化酶在神经干细胞及其早期分化中的表达

            芳香化酶在神经干细胞及其早期分化中的表达
            作者：肖岚　李巍　蔡文琴　周向东
            单位：第三军医大学组织学胚胎学教研室，重庆　400038
            关键词：芳香化酶；神经干细胞；细胞分化；基因表达
            　【摘要】目的　研究芳香化酶在神经干细胞及其分化后的基因表达。 方法　神经干细胞培养，免疫细胞化学及RT-PCR技术。结果
            　神经干细胞内有芳香化酶的基因表达，其分化后神经元中芳香化酶强表达而神经 胶质
            细胞中弱表达；这些细胞中芳香化酶的表达主要受脑组织特异启动子1.4驱动。结论　可能为中枢神经系统内雌激素的来源提供新的线索。
            　【中图分类号】R977.1+2；R322.81；R329.2+8　【文献标识码】A　【文章编号】0529-1356(2000)-增-188
            EXPRESSION OF AROMATASE CYCOCHROME P-450　IN THE NEURAL STEM CELLS
            AND THE EARLY DIFFERENTIATED CELLS
            XIAO Lan， LI Wei， CAI Wen-qin*，ZHOU Xiang-dong
            (Department of Histology and Embryology,the Third Military Medical
            Univ ersity,Chongqing 400038,China)
            【Abstract】Objective To explore the gene expression in the neur al
            stem cells as well as the cells after the clone was differentiated.
            Methods Neural stem cell culture,Immunocytochemistry and RT-PCR
            techniq ue were used.Results There was Aromatase expression in the
            neur al stem cells,after the stem cells were differentiated,the
            Aromatase strongly expre s sed in the neruons and weakly expressed
            in the astrocytes.The aromatase gene in these cells was expressed by
            means of the brain-specific promoter 1 .4 .Conclusion It may provid
            a new clue for the source of estrogen in the central nerve system.
            【Key words】Aromatase；Neural stem cell；Cell differentiat ion；Gene
            expression
            　近年来发现，雌激素可作为一些神经退行性疾病如 Parkinson 和 Alzheimer
            病的保护因子，因而，在神经科学领域中倍受关注。研究表明，中枢神经系统中雌激素通过其受体的作用可调节神经细胞的迁移、生存、死亡及突触可塑性而影响脑的性分化，调节神经内分泌及运动认知功能，发挥神经营养作用［1］。如能提高脑局部雌激素水平将不失为治疗相关神经退行性疾病的有效手段。但雌激素是一种非基因产物，它主要由雄激素经芳香化酶(aromatase)催化生成，因此，作为雌激素生物合成的最后一步限速酶，芳香化酶细胞色素
            P450 逐渐引起了人们的关注。
            　　芳香化酶不仅存在于绝经后妇女的卵巢、胎盘及脂肪组织中，而且在中枢神经系统发育中有广泛表达，尤以下丘脑和边缘系统中活性最高，随脑的发育成熟，其活性逐渐减至成体水平［2］。大量文献及我们的研究均表明脑内芳香化酶主要定位于神经元，胶质细胞中是否有芳香化酶的表达尚存在争议。
            　　90年代初，神经干细胞概念的提出及体外的成功分离培养为中枢神经系统功能重建和神经再生提供了新的思路［3］。作为一种具神经元和胶质细胞分化潜能的神经干细胞，它是否具有雌激素合成能力，能否作为中枢神经系统的雌激素的供体源呢?为此，本研究以神经干细胞为模型，用免疫细胞化学和
            RT-PCR 技术研i芳香化酶 P450
            在神经干细胞及其诱导分化中的基因表达及其分子基础，以期能为中枢神经系统功能重建和神经再生的激素治疗提供一定的基础资料。
            材料和方法
            1.神经干细胞的分离培养
            　　参照刘仕勇［3］的方法，取12.5 d Wistar
            胚鼠(第三军医大学动物中心)胚脑泡，吸管吹打机械分离制成单细胞悬液，相差显微镜下计数后，于每培养瓶(75ml)中加入5×105个细胞，使用
            DMEM/F12 加 B27(Gibco) 的无血清培养基，同时加用
            bFGF(20mg/L)(Sigma)。待原代克隆形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，5×104个细胞／瓶，此后每5～7
            d机械分离克隆传代 1 次。
            2.神经干细胞诱导分化
            　　选取部分上述的细胞克隆悬液种植于50ml培养瓶及预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的24孔培养板。并加入有血清培养基(10%胎牛血清+DMEM/F12)，分别于
            24h 及 48h 后行免疫细胞化学染色。培养瓶中细胞长满 (48h) 后，提取总 RNA。
            3.神经干细胞及其分化后的免疫细胞化学染色
            　　将所得克隆细胞悬液直接滴于多聚赖氨酸涂布载玻片上凉干，Zamboni固定20min，分化后的神经干细胞用Zamboni液固定20min后行免疫组织化学
            SABC 染色。用 Nestin 免疫荧光对所得克隆进行鉴定。用 NSE 及 GFAP (北京中山公司)
            免疫组织化学确定所得克隆能分化为神经元和神经胶质细胞。用抗 Aromatase IgG (1∶100) (美国 Beckman
            研究所周度金教授惠赠)检测芳香化酶的表达。染色程序按SABC(博士德公司)试剂盒说明进行。
            4.逆转录PCR
            　4.1　引物设计：Aromatase 编码区下游引物 P3：5’-CCAGACTCTCATGAACTCTC-3’。Aromatase
            第 2 外显子上游引物 P1：5’-GTTCTTGGAAATGCTGAACC-3’，下游引物
            P2：5’-TCACAATTCCAAATCAGGAG-3’，Aromatase 启动子共同下游引物
            RT-8：5’-CAGGAATCTGCCGTGGGGAT-3’，启动子1.3上游引物
            RT-3’：5’-CATAAGGTTCTATCAGACC-3’，启动1.4上游引物
            RT-4：5’-GTGACCAACTGGAGCCTG-3’，启动子 PⅡ上游引物
            RT-2：5’-GCAACAGGAGCTATAGAT-3’。引物的设计参考 Honda 等［4］文献，由上海生物工程公司合成。
            　4.2　RT-PCR：参照 TriPure 试剂盒(BM公司)说明，提取细胞(2×106)总 RNA，经紫外分光光度计检测 A
            值后用于逆转录反应，取总 RNA4μg，分别用下游引物 P3 及 RT-8 按 M-MLV(Promega)试剂盒说明进行逆转录。以
            P3 逆转录的产物用引物 P1、P2 扩增芳香化酶基因的编码区；扩增片段为 105bp。以 RT-8 逆转录产物用上游引物
            RT-3、RT-4 及 RT-2和共同的下游引物 RT-8
            扩增芳香化酶组织特异启动子。各扩增片段的长度分别是：1.3为395bp；1.4为249bp；PⅡ为305bp。PCR条件为94℃
            1min，54℃ 40s，72℃ 1.5min，共35个循环。
            结果和讨论
            　　神经干细胞这一概念是 Reynolds 和 Weiss 于 1992
            年提出的，指能在体外不断分裂增殖，具有多种分化潜能的细胞群；由于此类细胞群须在丝裂原生长因子的刺激下才能维持干细胞的特性，因此被称为生长因子维系的神经干细胞。刘仕勇等［3］利用
            DMEM/B27 无血清培养基加 bFGF 成功地获得了大鼠胚胎和成年的神经干细胞。本实验参考刘仕勇的方法从 12.5d
            的鼠胚中分离培养出类似的细胞克隆，Nestin 免疫荧光阳性；细胞克胞经 10% 的胎牛血清诱导后，细胞贴壁分化为少量 NSE
            阳性的神经元(少于20%)和大量 GFAP
            阳性的星形胶质细胞(大于60%)，与刘仕勇的结果基本一致。以上证明，我们获得的细胞是胚胎早期的具有分化为神经元和胶质细胞潜能的神经干细胞。
            　　芳香化酶免疫组织化学结果显示，Aromatase
            免疫反应物沉积于细胞克隆中绝大部分干细胞胞浆中，也见于一些单个的尚未分裂的干细胞中(图
            1)；干细胞经诱导分化后，一些有1个或2个长突起，胞体呈圆形或卵圆形的神经元样细胞，Aromatase
            呈强免疫反应，而大量具有多个粗长突起，胞体较为扁平的星形胶质样细胞为 Aromatase
            免疫反应弱或阴性(图2，3)。阴性对照未见阳性反应。
            　　RT-PCR结果显示，Aromatase 编码区及启动子1.4两个特异性扩增带，而未发现启动子1.3和PⅡ的特异性扩增带(图4)。
            　　以上结果在一定程度上丰富了对脑内芳香化酶的认识，可能为中枢神经系统内雌激素的来源提供新的线索。关于芳香化酶基因在神经干细胞内的表达以及其分化后神经元中强表达，而神经胶质细胞中弱表达目前尚未见文献报道。可能由于神经干细胞是近几年才出现的新概念，而且其分离培养技术尚未普及，关于胶质细胞中芳香化酶表达情况，Garcia-Segura等［5］曾报道在脑损伤后，星形脑质细胞中检测到芳香化酶的表达。当然，由于本实验中神经干细胞是体外分离培养得到的，因此也不能排除因培养因素刺激对细胞的基因表达造成的影响，而且干细胞内的芳香化酶是否具有催化雄激素转化为雌激素的活性尚待研究。
            　　研究表明，芳香化酶P450基因其 cDNA
            序列由10个外显子组成，翻译的起始密码子位于第2外显子，第1外显子为组织特异性启动子。目前，已发现有10个不同的启动子序列，他们是：1.1(1a)、1.2(1e)、1.3(1c)、1.4(1b)、1.5、1.6、1d、1f、2a和PⅡ。




            图4　电泳鉴定RT-PCR产物：a.启动子PⅡ(未见特异带　b.启动子1.3(未见特异带)　c.启动子1.4(249bp)　d.第2外显子(105bp)　M.PCR
            Mark
            Fig.4 The electrophoretic analysis for RT-PCR product: a,pⅡ(no
            product) b,promoter 1.3(no product) c,promoter 1.4(249bp) d,the 2nd
            exon (105bp) M,PCR Mark其中1.3、1.4


            图1 神经干细胞呈Aromatase阳性。SABC-AP法 ×400
            　　图2 干细胞诱导分化后24h，出现 Aromatase反应，SABC-AP法 ×200
            　　图3 干细胞诱导分化后48h，神经元(↑) Aromatase出现强免疫反应，星形胶质细胞(▲)呈 弱阳性。SABC-AP法

×200
            　　Fig.1 Aromatase positive of neural stem cells.SABC-AP ×400
            　　Fig.2 24 hours after the stem cells were differentiated,the cells
            are Aromatase positive.SABC-AP ×200
            　　Fig.3 48 hours after the stem cells were differentiated,Aromatase
            strongl y positi ve in the neurons(↑)，weakly positive in the
            astrocytes (▲).
            SABC-AP ×400
            【基金项目】国家自然科学基金资助项目 (39870274)
            【作者简介】肖岚(1967—)，女(汉族)，云南省人，硕士，讲师
            参考文献
            ［1］ Cordian B.Estrogen and the developing mammalian brain ［J］.Ana t
            Embryol，1999，199：379-390.
            ［2］ Lephart ED.A review of brain aromatase cytochrom P450 ［J］.Brain
            R eseach Reviews,1996,22：1-26.
            ［3］ 刘仕勇，张可成，杨辉，等.神经干细胞的分离培养及其鉴定［J］.第三 军医大学学报，2000，22(1)：26-28.
            ［4］ Honda SI,Harada N,Takagi Y.The alternative exons l of the mouse
            aro marase cy tochrome P-450 gene［J］.Biochimica et Biophysica
            Acta,1996,1305：145-150 .
            ［5］ Garcia-Segura LM,Wozniak A,et al.Aromatase expression by
            astrocyt es after brain injury:implications for local estrogen
            formation in brain repair ［J］.Neuroscience,1999,89(2)：567-578.
            【收稿日期】2000-08-04　【修回日期】2000-08-15





http://www.37c.com.cn/literature/analecta/data/jpxb/200000/zk031.html