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量化成像流式细胞技术在心血管研究中的应用

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xxx567 发表于 2015-8-13 15:53:58 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 xxx567 于 2015-8-13 15:57 编辑

       “我国每5个成年人中就有1个心血管病患者,每10秒钟就有1人死于心血管疾病“,心血管疾病在致中国城镇与农村居民死亡疾病中占首位。因此可见,心血管疾病的预防与治疗是未来临床与科研重点关注的研究方向。转化医学这一概念的提出促进了临床实践向基础研究提出新的命题,基础研究提出可能的解决方案进行临床验证,相互转化。目前中国转化医学的研究重点在心血管疾病与肿瘤,集中在疾病的发病机制、疾病的早期非创伤性诊断、疾病的规范治疗及新药物新技术的开发等。细胞水平建立体外疾病模型从而研究相关发病机制与治疗手段,是心血管疾病关注的重要方向。流式细胞检测和显微成像,是细胞水平研究的两大传统方法。利用流式细胞技术,科研人员可以分析上万个细胞,获得每个细胞的相对大小、颗粒度和荧光信号的数值,从而得到细胞群体的各种统计数据,筛选出稀有的细胞亚群。但是传统流式细胞检测技术存在一定局限,获得高通量的同时忽略了细胞承载的丰富信息。研究人员仅仅得到散点图上的一个点,而不是真实的细胞图像,缺乏细胞形态、亚细胞器结构与荧光信号空间分布的相关信息。要想获得基于细胞图像的数据,研究人员必须借助各种显微成像设备进行观察,但显微镜能够观察到的细胞数量是非常有限的,容易遗漏稀少事件,手动分析数据耗费大量人力和时间,而且受实验人员的主观因素影响,实验结果的稳定性很差,难以提供准确的细胞群体量化与统计数据。因此,量化成像流式细胞技术(ImageStream)的出现结合了流式检测的高通量与荧光显微镜的高内涵,同时提供细胞图像与群体统计数据,给传统细胞分析带来了重大变革,在流式细胞分析、分选的传统技术之外开创了“成像流式“下一代专家级流式细胞技术的发展方向。
      心脑血管研究经常涉及分离分析原位组织中的干细胞、前体细胞等,若仅仅使用传统流式分析方法,难以精确鉴定细胞。荧光显微镜又受通量的限制,难以捕获稀有现象。量化成像流式细胞技术的优势在于高功率激光器与785nm SSC专用激光器适合分析低含量细胞,结合了量化成像高内涵与传统流式分析的高通量特点,准确显示稀有细胞的形态学特性,并可进一步结合细胞表面与内部标记物确认该细胞群生物学功能。极小胚胎样干细胞(VSELs)是指人类血液及骨髓中存在的一类体积非常小、数量非常稀少的多能干细胞,被认为具有替代胚胎干细胞的潜力,其在科学界深受重视。然而,这种细胞真的存在吗?来自肯塔基大学的一个心血管疾病研究小组利用ImageStream发现了心肌缺血患者VSELs迁移到外周血的证据(图一),骨髓中这群细胞的比例仅为0.01%,表达CXCR4+、SSEA+、Oct4+和Nanog+。研究人员精确地了解到VSELs的直径约为3.6微米左右,而造血干细胞HSC的直径较大些,大约为6.5微米。对于核/质比的分析发现,VSELs的核/质比显著高于HSCs,细胞质区显著小于HSCs。组织器官受损时(如该研究证实的心肌梗死),VSELs可能从骨髓中释放入血液循环中,以参与损伤修复过程。而受损组织炎性因子或趋化因子的释放,也会影响VSELs向损伤区域或其他脏器的归巢。与此类似,ImageStream可应用与心肌组织干细胞研究,结合高通量与形态精确鉴定,研究信号通路的活化。
                                               
图一:心肌萎缩病人的极小胚胎样干细胞VSELs迁移到外周血中。Lin/CD45为造血干细胞HSCs的标记物,Oct4和CD34为极小胚胎样干细胞VSELs的标志物,7-AAD标记细胞核,该研究使用了ImageStream系统检测VSELs,显示了明场图像与biomarker的荧光成像,发现Oct4可以与细胞核共定位

      细胞自噬是一种利用溶酶体对自身细胞器进行分解、将产生的大分子物质予以回收利用的高度保守的细胞降解过程。饥饿、缺血、氧化应激等均可诱导其发生。自噬的调节也与心血管疾病相关,包括心脏肥大、缺血性心脏病、心力衰竭以及缺血-再灌注损伤。正常的细胞自噬对心肌细胞有保护作用,自噬不足或自噬过度则可促发疾病或加重病变量化成像分析技术可以(1)借助多种细胞表面与内部标记物追踪自噬蛋白与自噬小体的变化,(2)统计自噬蛋白与溶酶体的共定位,(3)研究自噬蛋白与受体的相互作用,并可组合多种应用模块量化分析(4)细胞自噬与凋亡的关系、涉及的上下游信号分子。ImageStream技术在自噬方面的研究成果已有多篇发表于Science、Oncogene、Autophage、Journal of Immunology等高水平专业杂志。
      ImageStream技术建立在传统的流式细胞术基础之上,结合了荧光显微成像技术,它具有12个检测通道,可以对流动中的每个细胞进行成像,并实现了对细胞图像各种形态学参数量化分析,获得全新的细胞形态统计学数据。ImageStream技术与传统流式细胞仪很类似,其系统平台也是由液流系统,光学系统和检测系统三大部分组成。液流系统通过注射泵将样本细胞悬液和系统鞘液注入流动室中,细胞在鞘液流的约束下聚焦在液流的中心,逐个流过检测窗口。光学系统中光源照射通过检测窗口的细胞,从而产生光信号。光源分为两种,其一用于产生明场细胞图像,另一种是用于产生荧光细胞图像的激光器。独特、定制的全固态激光器,功率高且可调节,有利于同时检测多种荧光信号或是微弱信号。本系统拥有一个独特的785 nm激光器,用于检测侧向角(SSC)参数,极大提高了该参数的检测灵敏度。光源照射细胞产生的光信号被大数值孔径的物镜收集,然后通过光路系统传递到由二向色镜构成的滤光片堆栈。光信号在这里被分成不同波段投射到CCD的相应检测通道上,产生明场细胞图像、暗场细胞图像和多个荧光通道的细胞图像,即每个细胞可以获取12副不同成像。ImageStream技术的检测系统十分独特,采用不是传统流式细胞仪的PMT检测方式,而是基于时间延迟积分技术的CCD(TDI (time delay integration) CCD)采集,保证了系统对高速运动的流体细胞也能采集高质量图像。

图二:系统性红斑狼疮SLE病人与正常人群相比,免疫细胞自噬程度增高。绿色荧光标记LC3自噬蛋白,在High高自噬情况下,LC3发生聚集。CD19、CD4、CD14分别标记B细胞、T细胞和单核细胞。来源:Autophagy is activated in systemic lupuserythematosus and required for plasmablast development.Ann Rheum Dis. 2015 May; 74(5): 912–920.
      ImageStream系统配有功能强大的数据分析软件IDEAS®, 可以对每个细胞的图形进行超过100种量化参数分析。这些参数不仅包括细胞整体的散射光和荧光信号强度,还包括对细胞形态,细胞结构及亚细胞信号分布的分析。点击散点图上的点,就可以直观的看到这个点代表的细胞的图像。目前已经广泛应用于细胞信号转导、细胞共定位、细胞形态变化、胞间相互作用、细胞自噬等典型应用,从而提高了软件的易用性。另外,使用者还能够根据自身研究的特殊需要,自定义参数的设定,进行更深入的分析。因而,科学家们既可以将其应用于基础生命科学研究,如免疫学、生物化学、转录组学等等,又可以用于深入了解某些疾病的发病机制。从2005年至今,利用量化成像流式细胞技术已经发表了超过500篇的同行评议文章,其中已有多篇文章发表在Science、Nature、Immunity等顶尖杂志上,说明该技术已经得到了科研界的广泛肯定。

      随着ImageStream技术的应用不断推广,科学家们已拓展了大量灵活新颖的应用。例如,量化成像流式技术可以识别20nm直径的微粒,非常适合分析心血管疾病涉及的循环微粒、微囊泡;通过多色标记,检测血小板聚集,评估血栓形成;量化分析纳米靶向药物是否有效等。相信下一代专家级流式必将助力心血管疾病细化研究。

更多ImageStream量化成像流式技术创新应用,请访问Amnis量化成像分析流式技术站
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