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免疫细胞的制备方法和注意事项

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engreen 发表于 2016-8-19 16:32:34 | 显示全部楼层 |阅读模式


随着免疫细胞生物学和分子生物学的快速发展,免疫治疗已成为肿瘤患者放、化疗和手术后辅助治疗的重要手段之一。过继免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,ACI)是近年来引起关注的免疫治疗方法。ACI 是通过将具有抗肿瘤活性,能直接或间接介导抗肿瘤效应的免疫细胞注肿瘤宿主体内的一种治疗方法。ACI应用的免疫细胞主要为 T 细胞、自然杀伤细胞 (natural killer cell,NK) 、NK 细胞样 T 淋巴细胞(NKT细胞)、抗原修饰的自体CTL(rAAV-DC)免疫治疗、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrationlymphocyte,TIL) 和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killercell,CIK),以及最近研究较热的抗原嵌合受体修饰的T细胞(CAR-T)等。无论是临床应用哪种免疫细胞治疗疾病,都必须要遵循<自体免疫细胞(T细胞、NK)治疗技术管理规范>,保证医疗质量,为临床免疫细胞治疗提供安全有效的细胞产品。

为保证细胞产品出库无毒,无害、安全有效。必须从细胞制备前期、培养期及临床回输前期各个环节做好严格的质量监控。1.细胞制备前期需要注意的事项:1.1细胞培养所用原料耗材的统一订购,确保培养培养体系的稳定性。务必做细胞培养成分和添加物(培养液、细胞因子、血清等)以及制备过程所用耗材的来源和质量认证,应符合临床使用的质量要求。由于采用不同的细胞分离和扩增技术(培养基体系),可能得到的结果有较大差异。

1.2.按2003年中国药品食品监督管理局发布的《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》,规定人体细胞培养中“不得使用同种异体人血清或血浆。原则上鼓励采用无血清培养基、自体血清或者自体血浆。如果必须使用动物血清,应考虑每批血清都应对潜在的外源因子(包括人的病原体)进行检查、筛查。”

因此我们实验室要做到针对细胞培养的每批耗材试剂进行定期抽检,确保每批耗材试剂做到无菌,无热源,无外源病原体。

2细胞培养期要注意的事项:2.1确保血液来源的检测:血液样本实验前无菌处理,留样做检测,确保无菌,无病原体.以备后续实验顺利进行。2.2血液细胞的采集运输,要注意血液运输的容器、温度(用冰袋和海绵隔离,血样样本不要直接接触冰块)、时间(不超过24小时)、并做好相关记录。

2.3细胞的培养过程,要严格按照无菌操作规程来制备,细胞培养人员要具有较强的无菌意识,并贯彻整个细胞培养过程中。免疫细胞培养大致时间14-18天,培养过程中要严格按照实验技术流程SOP来执行。


血液中各类细胞的分选方法,培养基及因子的添加量要准确;补液换液前对细胞计数,观察培养基颜色变化情况,进行合理的补液,保持细胞合适的生长密度,确保培养体系的稳定性,以达到细胞预期的生长数量;同时做好补液记录,对细胞培养瓶进行编号,实验分组操作,避免交叉污染,分工明确,以便出现问题有据可查。

2.4细胞的质控:细胞培养期间,每天观察细胞培养形态,每三天取样检查细菌、内毒素、真菌,如有异常及时复查,弃掉污染细胞。细菌污染时培养基多出现浑浊,在镜下观察时多出现黑色跳动小点。真菌多为霉菌污染时,初期为镜下可见圆形漂浮或贴辅的空心圆泡,后期可见明显霉斑,镜下可见菌丝为树枝状。细胞污染后培养箱的处理较为重要,培养箱应拆下内部组件,彻底清洗,用过氧乙酸擦拭后再用新洁尔灭擦拭,然后用酒精擦拭,紫外照射30min,最后用75%的酒精(40℃,CO2为零)培养箱内部熏蒸3~4h;污染严重时要将其放入烘箱内100~200℃烘3~4h安装后再照紫外。每次做新一批细胞培养时要将培养箱彻底擦拭;培养基因子等不能照紫外的试剂,经传递窗带进无菌间后用酒精棉球擦拭三遍;方可带入超净台。

3细胞回输前期注意事项:

3.1临床回输免疫细胞前细胞的安全性检测:要确保培养的细胞成品,无菌、无内毒素、无支原体、无真菌污染,所有检测结果真实、权威。在患者使用前,取培养液及或沉淀物用丫啶橙染色或革兰染色,追加一次污染检测。

3.2细胞的有效性检测:细胞回输剂量、存活率、形态,纯度。回输剂量要达到临床治疗应用标准,存活率大于90%,应用流式细胞仪检测效应细胞及表达特定表型的细胞(CD3+/CD56+/CD8+/CD4+)占总细胞的比例,是否达到临床应用标准;分泌某种杀伤肿瘤细胞的效应因子(IFN-γ)的能力是否达到临床应用水平。

综上,免疫细胞制备需要具有较强专业素质的培养人员,更需要注入细心,耐心和恒心培养出高质量的安全有效的免疫细胞治疗产品,为临床细胞治疗提供强有力的保障,为广大患者带来福音。

文章来源:英格恩技术的官方博客,原文详见:http://www.engreen.cn/免疫细胞制备的事项
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