体外蛋白质组表达技术——破解人类蛋白质组奥秘的利器

xiaofang 发表于 2009-1-16 10:23:00

消息来源：<a href="http://www.lifeomics.com">www.lifeomics.com</a> 基于已有的大量人类基因克隆和经过改进的体外高通量表达有活性蛋白质技术，现在人们已经可以在体外对将近15000个人类基因进行蛋白质组水平的研究了。 能够快捷地在体外大量表达蛋白质是人们了解细胞内蛋白质如何发挥功能以及蛋白质之间是如何相互作用的先决条件。Nomura等人将向我们介绍一种完全在体外高通量表达蛋白质的方法，使用这种方法得到的蛋白质由于具有活性，所以可以广泛用于蛋白质功能研究。 利用已经非常成熟的高通量基因克隆技术，Goshima小组对人类22000个基因中70%的基因制备了两用克隆，这一成果是非常惊人的。然后他们使用最先进的体外蛋白质表达技术表达出了成百上千种具有生物学活性的蛋白质，这已经达到了蛋白质组研究的需要了。 对于人类或模式生物基因组编码的蛋白质功能方面的研究远远落后于对这些基因组本身的研究。主要原因有两点。第一，由于DNA本身的生化特性（碱基互补、化学性质稳定、均一等）决定了测序技术比较容易得到发展，相比之下，有关蛋白质测序的研究手段就非常少了；第二，DNA序列在所有的细胞中都是一致的，但蛋白质的表达在不同的细胞内不论从数量上还是其它方面（是否表达、有没有编辑、剪切，表达后修饰等等情况）都是千变万化及复杂多变的。也许很快，只花1000 美元就能够测得一个人的完整基因组序列了，但要得到一个人完整的蛋白质组生化特性，还至少需要花费10亿美元。 有一种办法可以用来研究蛋白质的功能，那就是将模式生物体内所有编码蛋白质的基因集中起来。这里所谓的“基因”指的是从mRNA逆转录得到的cDNA，即包含编码蛋白质序列的开放读码框序列（ORF）。国际上一直在努力克隆得到人类和模式生物的各种cDNA，他们都希望能得到mRNA的全长逆转录本，不过如果只是为了表达蛋白，只需要cDNA中的开放读码框序列就足够了。 科研界已经得到了大量的蠕虫（worm）、人类和酵母的ORF序列，并在体内进行了蛋白质研究。不过，现在我们已经有了可以进行体外研究的新方法了。Goshima小组利用其他人的成果将人类基因组22000个基因中70%基因的cDNA构建了人类的cDNA文库，然后又用通路克隆技术（Gateway cloning technology通路克隆技术能通过特异位点重组高通量地将ORF序列任意转换载体）构建了两个人类基因ORF库。其中一个库中的ORF序列含有终止密码子，得到的蛋白质和天然蛋白质具有同样的C末端。而另一个库中则没有终止密码子，因此得到的是与载体标签融合的蛋白，可用于纯化或研究蛋白间相互作用。为了能更多更好地表达蛋白，Goshima小组还将ORF序列构建到了另外的35种载体上，这也极大丰富了可用于通路克隆技术的载体种类。 为了跟上试验手段的最新发展，Goshima小组还将通路克隆技术得到的ORF克隆文库在麦胚提取物转录/翻译偶联系统（coupled wheat germ in vitro transcription and translation, IVT）中进行了体外转录和翻译，将得到的蛋白质用于功能研究，以此来绕开体内表达系统繁琐的操作以及后续的纯化等试验步骤。Goshima小组对使用不同的载体和得到的不同C末端蛋白质进行了分析，评价了不同载体表达出来的蛋白质活性有何不同，结果他们发现的确存在着一些差异，例如和标签融合表达的蛋白质往往得率较高，而且具有生物学功能。 为了能使用通路克隆技术大批量地给ORF库基因加上标签，Goshima小组发明了两种方法，这样可以更好、更高效地使用他们的ORF库（图1）。 首先，Goshima小组直接在通路亚克隆反应（Gateway subcloning reactions）中使用PCR技术，从而获得要在IVT系统中表达的模板DNA片段，这样就绕过了从大肠杆菌中扩增、纯化质粒这一步骤，既省力更省钱。 其次，只需一点点PCR产物就可以直接用于体外蛋白质表达了，并且每一次PCR反应得到的模板都够用好几轮体外表达反应。不过通路克隆技术也有其缺点，那就是有时需要重复几次操作才能得到结果。如果选择的PCR引物合适，在使用IVT体外表达系统时还有可能表达其它的cDNA，这样我们能研究的基因数量就将更多了。 随后，Goshima小组又非常聪明地直接利用IVT反应制作了蛋白质芯片，他们制作的芯片能携带超过13000种人类蛋白质。由于IVT反应本身能发出绿色荧光，同时表达出的人类蛋白又可以被相应的红色荧光标记的抗体识别，所以，如果将IVT反应体系直接在玻片上点样制成芯片，就可以同时监测每一个IVT 反应的情况（通过监测绿色荧光信号）和每一种蛋白质的表达量了（通过监测红色荧光信号）。 在本试验中，科研人员得到了许多种具有生物学活性的蛋白质。在对随机选择的96个ORF序列进行IVT体外表达的试验中，最后通过变性凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检测，有2/3的蛋白可溶性表达量超过了10mg/ml。这已经和使用大肠杆菌表达人类蛋白质的得率相当了，尤其还是在蛋白质的分子量都大于 50KDa的情况下。许多膜蛋白也能够得到高产量的可溶性表达。科研人员还使用IVT系统得到了有活性的细胞因子、有活性的磷酸酶和能够自身磷酸化的酪氨酸激酶。 本文中介绍的技术和基因资源以及其它人类ORF组资源，例如ORF组协会（ORFeome collaboration）的出现使得人类蛋白质组学的研究向前跨进了一大步。也使得降低蛋白质组学研究的费用成为了可能。对ORF 资源能否最大化利用的关键就是所有的ORF资源能否像基因数据库那样都能够供大家方便的使用。例如，如果要研究某个信号通路的科研人员能使用某几个ORF 资源库和IVT表达系统，那他们就能很方便地在体外表达出他们所需要的蛋白质用于研究了。 可以预见，像Goshima小组这样，使用人类和模式生物的ORF库加上高效的体外表达系统以及今后可能出现的新技术，了解蛋白质组学的奥秘将不再困难。 图1 图示说明通路克隆技术和高通量体外蛋白质表达技术在体外表达并鉴定带标签人类蛋白质的试验流程。蓝色框示IVT反应。 原文检索：www.nature.com YORK/编译 James L. Hartley, Kourosh Salehi-Ashtiani, David E. Hill/原文作者 James L. Hartley就职于美国马里兰州弗雷德里克美国国家癌症研究所SAIC-Frederick公司。e-mail: hartley@ncifcrf.gov Kourosh Salehi-Ashtiani就职于美国马萨诸塞州波士顿市达纳法伯癌症研究所肿瘤系统生物学研究中心。e-mail:kourosh_salehi-ashtiani@dfci.harvard.edu David E. Hill就职于美国马萨诸塞州波士顿市达纳法伯癌症研究所肿瘤生物学研究中心。e-mail:david_hill@dfci.harvard.edu 小词典： 1. Gateway技术：通路克隆技术是一项基因克隆和表达的新技术，通过Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统。这项体外技术大大简化了基因克隆和亚克隆的步骤，克隆效率却高于95%。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，可以保证正确的方向和阅读框。此外，Gateway技术也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。 Gateway 技术利用了位点特异性重组，所以在构建好入门克隆(entry clone)后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦拥有了一个入门克隆，就可以多次使用，转移目的基因到Gateway兼容的各种表达载体（destination vector）。由于重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不必再对新的表达克隆进行测序。这样，在使用每一种新的表达系统时，将会节省更多时间。 Gateway 技术基于已深入研究的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体（Donor vector）之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。 Gateway技术具有以下优点： •去除冗长的亚克隆步骤，节省操作时间； •能同时将基因转移到多个表达系统； •在选择的任何系统——体外、细菌、酵母、昆虫或哺乳动物——进行分析表达。 完成构建Gateway表达克隆仅需两步： 1) 创建入门克隆，通过PCR或者传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆。在BP反应中，基因转移形成入门克隆；在LR反应中，入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。 2)一旦构建好Gateway入门克隆，蛋白表达和分析的大门就会敞开。使用Gateway技术，可以进入到几乎是无数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统适合于每一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析目的蛋白。 2.ORFeome Collaboration：ORF组协会成立于2005年末，旨在满足全世界科研人员对高可信度的人类全长ORF序列的需要。该协会的目标是为目前已经确认的18500个人类基因构建全长ORF片段克隆。这些克隆将通过商业运作模式向全世界的科研工作者开放使用，没有任何限制。 　 　 参考文献： 1. Goshima, N. et al. Nat. Methods 5, 1011-1017 (2008). 2. Walhout, A.J. et al. Methods Enzymol. 328,575-592 (2000) 3. Sawasaki, T. et al. FEBS Lett. 514, 102-105 (2002). 4. The MGC project team. Genome Res. 14, 2121-2127 (2004). 5. Imanishi, T. et al. PLoS Biol 2, e162 (2004). 6. Reboul, J. et al. Nat. Genet. 34, 35-41 (2003) 7. Rual, J.F. et al. Genome Res. 14, 2128-2135 (2004). 8. Gelperin, D.M. et al. Genes Dev. 19, 2816-2826(2005). 9. Ramachandran, N. et al. Science 305, 86-90(2004). 10. Gileadi, O. et al. J. Struct. Funct. Genomics 8, 107-119 (2007) 11. Lamesch, P. et al. Genomics 89, 307-315 (2007) 12. Temple, G. et al. Hum. Mol. Genet. 15, R31-R43 (2006).

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