海马神经元培养

求助各位战友，我做原代培养的海马神经元，开始的几次培养都挺好的，国庆节以后，有两次96孔板中的细胞养得不错，爬片上的细胞几乎都脱片了，后面重新包被玻片，再次原代培养的时候，96孔板中的细胞长得不好了，爬片上的细胞长好了，最近这三次培养，96孔板和爬片上的细胞都不好，培养的第一天细胞状态还可以，数量也挺多的，不过第一天可能杂细胞要多一些，第二天，和以往培养的神经元相比，神经元数目少，神经胶质细胞较多，加了阿糖胞苷以后，胶质细胞明显减少，神经元也变得更少了，崩解明显，我的操作是一样的，培养的方法也没变，多聚赖氨酸都没用回收的，但是细胞就不好了，真不知道原因了。我把我的方法大致说一下，请战友们帮忙分析一下，谢谢！
1.我是用96孔板和48孔板（爬片）培养神经元的，用分子量7~15万的多聚赖氨酸包被培养板和玻片，终浓度是0.025mg/ml，包被过夜后，第二天吸出多聚赖氨酸，把板子晾干。
2.用新生1天的SD大鼠取海马组织，用0.125%胰酶消化30分钟，含10%FBS的DMEM/F12终止消化，吹打至米糊状后，200目筛网过筛，1000转/分离心5分钟，弃上清，用10%FBS的DMEM/F12吹悬细胞，血球计数板计数后调整细胞密度后培养。
3.第二天换Neurobasal+B27+Gln培养，第三天加阿糖胞苷（终浓度10μmol/L）,培养三天后半定量换液。
再次感谢各位战友！

1.　查下有没有换过什么试剂
2.　如果胶质不多，不一定要加阿糖胞苷
3.　玻片有没有处理干净

回复 2# thinker

    谢谢战友的指导！
    我们在同一批细胞中，无血清培养基试过两种，做MTT检测发现差别不大。玻片是泡酸过夜后冲洗20遍，过蒸馏水3遍后高温高压消毒的，用前用多聚赖氨酸包被了的。所以不知道原因是什么细胞老长不好！

放显微镜下看，有没有污染，有时候能看到些小的细菌或焦虫。
还有海马裂解的时候吹打仔细些，不要太猛烈。

神经元的生长一日不如一日，一次不如一次啊，我前天原代培养的海马神经元，用加了Gln的10%FBS的DMEM/D12种的，种下了第二天（昨天）细胞挺好的，就是胶质细胞有点多，神经元的数量和状态都不错，昨天给细胞换了Neurobasal+B27+Gln培养基后，神经元数量减少，开始聚集成团，状态也不好了，感觉再聚下去就要崩解了，今天还给细胞加了阿糖胞苷的，不知道怎么回事细胞越养越差，请高手们给点指导啊！谢谢！

回复 4# thinker


    谢谢您，好像没有污染。

把这些Neurobasal+B27+Gln培养液全部重新换一个新的批号。阿糖胞苷也不要加。