[转贴]

一）酶桥法fficeffice" />

1．基本原理    首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节省第一抗体的用量。

2．染色步骤 主要程序如图4-4

图4-4　酶桥法主要染色步骤

（1）切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体（假设来自种属a）孵育24h（4℃）。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个fab段均与组织抗原结合，较牢固，漂洗时不易丢失。

（2）切片与第二抗体（也称桥抗体，抗种属a igg抗体）孵育1～1.5h（室温）。应用过量的桥抗体能保证一个fab段与第一抗体结合，另一个fab段游离。

（3）切片与抗酶抗体（来自种属a）孵育1～1.5h（室温）。因抗酶抗体和第一抗体均系种属a igg，具有相同的抗原性 ，所以 桥抗体游离的fab能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体连结在与 组织抗原结合的第一抗体上。

（4）切片与酶（hrp 70～100μg/ml,pbs溶解）孵育0.5h（室温），酶与抗酶抗体结合。

（5）显色等与酶标抗体法相同。

酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右）丢失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。为此70年代初，sternberger(1970)又建立了pap法，并加以改良，现为icc研究中常用的方法之一。

（二）pap法

1．pap的制备及特征 　pap复合物是离体制备的hrp抗hrp复合物，它的制备方法较多，现简介其中之一。

（1）制备抗hrp血清：健康雄性家兔（2.0kg以上），可先于足跖皮下注射灭活的卡介苗（共10mg），2周后重复1次，刺激机体免疫系统功能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点t射1.0ml乳剂[（福氏完全佐剂，含hrp3.3mg(rz=3.0) ];间隔2周第2次注射，背部注入含hrp3.3mg的不完全福氏佐剂1.0mg；再间隔2周，第3次注射，2mghrp（溶于2ml生理盐水中），分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1周后采静脉血，检查效价。再隔1周第4次加强注射（条件同第3次），一周后检查抗体效价，琼脂糖扩散法（hrp0.1mg/ml）为1：128以上时，颈动脉取血，制备血清低温保存备用。

（2）制备pap复合物：离体条件下，使兔抗hrp抗体与hrp形成可溶性复合物。在制备抗hrp血清时，hrp的纯度要高（rz≥3），而制备pap复合物时，hrp的质量要求不高，甚至可用酶的粗制品。

【步骤】

①取10.50ml抗hrp血清，加7.60ml含7.6mghrp（1.0mg/ml）的水溶液。

②混匀，室温1h后，离心16000g 4℃ 15min。

③0.9% nacl(冷盐水)溶解沉淀，离心16000g 4℃ 15min，重复4次。

④加15.3ml hrp水溶液（含hrp30.64mg），室温，持续搅拌。

⑤用1n hcl及0.1 n hcl调ph至2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用1n 及0.1n naoh调ph至7.2。

⑥慢慢加等体积的饱和硫酸铵，置0℃ 45min。

⑦离心35000g 0℃ 15min，沉淀用50%硫酸铵漂洗两次。

⑧用10.50ml水溶解沉淀，对透析液（48.6g nacl, 1.5n naoocch3 30ml, 3n(nh4)2so430ml, 水5.94l）透析，4℃离心，收集上清，加透析液使体积至10.50ml，分装低温保存。

【质量鉴定】

制备的pap复合物应检测酶和抗体的含量，以鉴定pap复合物的质量。常用分光光度计检测pap的复合物在280nm（ igg的最大吸收波长）和400nm（hrp的最大吸收波长）的光密度值（od值），按下式计算igg和hrp的含量： 　　　　

一般hrp/抗hrp的克分子比达1.9时，可分装冷藏于-85℃冰箱，据报告如此冷藏的pap复合物可保留14年之久，活性无改变。但稀释后的pap复合物不稳定，4℃可保存2～3周。最好临用前配制。

【pap复合物的特征】

pap复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗hrp抗体均参与形成可溶性pap复合物，仅残留少许游离的hrp，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。pap复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的pap复合物其hrp/抗hrp之比绝大部分为3：2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：pap复合物沉降系数为11.5s,分子量为400～430kd，由此可推算出酶与抗体之比为3：2，即每个pap生命物由3个hrp分子和2个抗hrp抗体组成，呈五角形结构，3个角为hrp，另两个角为抗hrp抗体。采用h2o2-dab染色，电镜下已经观察到pap复合物五角形环状结构，直径平均21nm 。这种结构异常稳定。据报告pap复合物的抗hrp抗体与hrp结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离hrp，亦不影响其稳定性。

2．pap染色原理及步骤

（1）原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是pap法将酶桥法的步骤3、4合并为1，用pap复合物代替，即第三步用pap复合物孵育切片，故称pap法。pap复合物中的抗hrp抗体和第一抗体为相同种属动物的igg，所以桥抗体能够作为“桥”将pap复合物连结在第一抗体上。

不错哦