成年大鼠纹状体区神经干细胞的分离培养

http://www.37c.com.cn/literature/analecta/data/jpxb/200001/005.html


 解剖学报 2000年第1期第0卷 论著
            成年大鼠纹状体区神经干细胞的分离培养
            作者：刘仕勇　张可成　杨辉　蔡文琴　何家全
            单位：刘仕勇（第三军医大学新桥医院神经外科，重庆 400037）；蔡文琴　何家全（第三军医大学组织学胚胎学教研室，重庆 400038）
            关键词：神经干细胞；克隆分析；细胞培养；分离；鉴定
            摘　要：目的　从成年大鼠纹状体区分离并鉴定神经干细胞。　方法　利用无血清培养和单细胞克隆技术在成年大鼠纹状体区分离具有单细胞克隆能力的细胞群，选取单个克隆进行连续传代培养获得大量亚克隆，采用免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。　结果　从纹状体区分离的细胞群具有连续克隆能力，表达神经上皮干细胞蛋白，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。　结论　分离的细胞具有自我更新能力和多分化潜能，表达神经上皮干细胞蛋白，有很强的增殖能力。是中枢神经系统的干细胞。
            分类号：Q813　文献标识码：A
            文章编号：0529-1356(2000)01-17
            ISOLATION OF NEURAL STEM CELLS FROM
            STRIATUM OF ADULT RATS
            LIU Shi-yong
            (Department of Neurosurgery,Xinqiao Hospital)
            ZHANG Ke-cheng
            (Department of Neurosurgery,Xinqiao Hospital)
            YANG Hui
            (Department of Neurosurgery,Xinqiao Hospital)
            CAI Wen-qing
            (Department of Histology and Embryology,The Third Military Medical
            University,Chongqing 400037,China)
            HE Jia-quan
            (Department of Histology and Embryology,The Third Military Medical
            University,Chongqing 400037,China)
            Abstract：Objective　To isolate neural stem cells from striatum of
            adult rats.Methods　A cell line which had ability to form clones was
            isolated from striatum of adult rats by using serum-free cell
            culture and single cell clone test.A clone was passaged continuously
            in order to acquire a large number of clones,and immunofluorescence
            was used to detect Nestin antigen of the clone and specific antigen
            of mature neural cell after the clone differentiated.Results　The
            cell line isolated from striatum of adult rats expresses Nestin
            antigen and has the potential to form clones and differentiate into
            neurons,astrocytes,and oligodendrocytes.Conclusion　Our cell line
            which expresses Nestin antigen is multipotent cell line and has
            ability to self-renew,and believed that it contains stem cells of
            the CNS.
            Key words：Neural stem cell;Clonal assay;Cell
            culture;Isolation;Identification;▲
            　　成年哺乳类动物神经系统通常被看作无再生能力的组织，意指神经细胞不能分裂增殖产生新生神经元以替代丢失、缺损的神经元。但近年来的研究对此提出了疑问。首先，人们发现成年个体海马和室管膜下层细胞具有分裂产生新生神经元的能力，尤其是位于室管膜下层的祖细胞增殖后可以沿着一条比较固定的路径迁移到嗅脑并分化为中间神经元［1～3］。其次，在90年代人们又分离了能不断分裂增殖且具有多种分化潜能的细胞群，并提出了神经干细胞的概念［4～6］。这种神经干细胞如能被特异性地诱导分化为某种特定神经元以替代丢失的神经元，无疑将为中枢神经系统功能重建和神经再生带来新的希望。本实验首次采用单细胞克隆建立细胞系的方法获取大量亚克隆，在证实其自我更新能力和多分化潜能基础上使用胚胎早期细胞特异性抗原Nestin证明我们所分离的细胞群为神经干细胞，以期为进一步使用和研究神经干细胞奠定基础。
            材料和方法
            1.动物及主要试剂来源
            　1.1　动物：由第三军医大学动物实验中心提供成年Wistar大鼠(4月大小)。
            　1.2　细胞培养试剂：DMEM/F12和B27(Gibco)、bFGF(Sigma)、胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所)。
            　1.3　单克隆抗体及多克隆抗体：抗Nestin IgG(Mckay RDG和Luskin
            MB惠赠，USA)、5-溴尿嘧啶及其抗体(bromodeoxyuridine,BrdU,Fluka公司提供)、抗NeuN
            IgG(neuronal nuclei,NeuN,由Dr
            Mcburney惠赠，USA)、抗GFAP和2，3-环核苷酸磷酸二脂酶IgG(cyclic nucleotide
            phosphohydrolase,CNP)由Promega公司提供。
            　1.4　其他试剂：SABC-Cy3荧光试剂盒(Sigma,博士德公司代理)、FITC荧光二抗(中山公司)。
            2.方法
            　2.1　神经干细胞的分离和传代：取成年大鼠(4月大小)纹状体组织，D-Hank液漂洗，解剖显微镜下剥离脑膜，将上述的脑组织转移到DMEM/F12(1∶1)加B27的无血清培养基，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数，于每培养瓶中(75ml培养瓶)加入5×105个细胞，同时加用bFGF(20μg/L)。待原代克隆形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，每培养瓶中加入5×104个细胞。此后每6～9d机械分离克隆传代1次，方法同前，仍采用无血清培养基加bFGF。在传代的同时进行克隆形成实验，计数每代细胞的克隆形成率。
            　2.2　单细胞克隆及连续传代：采用有限稀释法。选取原代克隆制作的单细胞悬液，细胞计数后稀释到40个细胞/ml，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液(每孔50μl细胞悬液和50μl无血清培养液，1～2个细胞/孔)，2h后相差显微镜下观察计数，选取仅有1个细胞的培养孔作记号，动态观察。
            　　选取最初只有1个细胞长成的单细胞克隆，机械分离成单细胞悬液，将1个克隆的所有细胞种入25ml培养瓶中培养(培养基仍同前)，待次代克隆长成后连续传代，最后得到大量来自单个细胞的亚克隆，再行免疫荧光和诱导分化实验。
            　2.3　BrdU标记：将BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后种入上述的细胞克隆(BrdU终浓度为5μmol/L)，培养7d待新的克隆形成后转移到培养板中(预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片)，贴壁2h行BrdU抗体免疫荧光染色。
            　2.4　克隆诱导分化：选取部分上述的细胞克隆种植于预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的24孔培养板，并加入有血清培养基(5%的胎牛血清+DMEM/F12)，分别于2h后和7d后行免疫荧光检测。
            　2.5　免疫荧光单标和双标实验：将2.4中贴壁2h的细胞克隆行Nestin免疫荧光单标染色。将来自2.2中的克隆(单细胞克隆后代)按2.4的方法培养7d后行NeuN、GFAP和CNP免疫荧光单标染色，来自2.1中的克隆按2.4的方法培养7d后行NeuN和GFAP免疫荧光双标染色，具体方法参照蔡文琴［7］教授的方法进行。
            结　果
            1.克隆分析
            　　成年大鼠纹状体原代培养细胞在上述的无血清培养基中生长2d后大部分细胞死亡，部分细胞分裂形成2～4个细胞的细胞I，并随时间的推移细胞数目迅速增加，到7d时生长成为数十个细胞到数百个细胞的集落，这些集落均成悬浮球形生长，细胞形态规则，未见到明显的突起生长(图1)。原代克隆的次代培养中发现部分细胞贴壁分化，生长出细长突起，呈散在分布(为分化的祖细胞)，仍出现与原代培养相同的大量次代克隆。在次代克隆的亚克隆培养过程中均出现与次代培养相类似的过程。在原代培养中克隆形成率约为0.5%～1%之间，而次代克隆及随后的亚克隆中克隆形成率则明显升高，波动在10%～20%之间。经传代20代后的细胞仍具有克隆能力(包括单细胞克隆)。为排除细胞的选择性聚集产生细胞集落的可能性，本实验采用单细胞克隆(见下文)。由于上述的克隆均呈悬浮生长，因此非常有利于传代培养。


            图1　无血清培养液中悬浮的克隆，体外培养第7d。　×200
            Fig.1　A floating clone curtured in serum-free media,7 days in
            vitro.　×200
            　　采用有限稀释法标记仅有1个细胞的培养孔并动态观察，结果显示单个细胞在培养2～3d后分裂为2～4个细胞的小克隆，4～5d出现10～40个细胞的中等大小的克隆，7～10d均发展为上百个细胞的大克隆，细胞形态同前。来自单个细胞的克隆连续传代后获得到大量亚克隆，分裂过程仍同上，呈悬浮球形生长。目前(1999年1月)已连续传代25代(＞6月)。
            2.Nestin抗原的表达和BrdU标记
            　　来自成年大鼠纹状体的原代克隆及次代克隆贴壁2h后行Nestin的免疫荧光染色，结果显示克隆呈Nestin抗原阳性(图2)。单细胞克隆后代结果与此相同。在传代20代后的克隆仍显示为Nestin抗原阳性。在克隆培养7d(有血清培养)后行Nestin免疫荧光染色，未见到任何Nestin阳性细胞。BrdU标记结果显示克隆的大部分细胞为BrdU阳性细胞，表明克隆主要由分裂增殖的细胞组成。


            图2　克隆细胞呈Nestin阳性(FITC免疫荧光)，贴壁2h后。　×200
            Fig.2　Nestin positive cells in a clone 2 hours after attachment in
            vitro(FITC immuno-fluorescence).　×200

3.诱导分化结果
            　　单细胞克隆后代种入预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的培养孔，2～4h后克隆贴壁，随后即发现有突起从团块边缘长出，7d后出现大量不同形态的分裂增殖新生神经细胞。细胞主要呈现3种形态，即具有1个或2个长突起胞体呈圆形或椭圆形的神经元样细胞、具有多个细突起且不断分枝的少突胶质细胞样细胞和具有多个粗长突起的星形胶质细胞样细胞。免疫荧光单标和双标染色证实了克隆细胞的多分化潜能。NeuN抗体为特异性识别神经元的核抗体，在单细胞克隆后代的细胞核内得到显示(图3)。GFAP阳性细胞显示了星形胶质细胞的粗长突起和多角形胞体(图4)。CNP为少突胶质细胞的特异性抗原，在本实验中亦见到了较多的CNP阳性细胞(图5)。免疫荧光双标证实了不同类型细胞的同时存在(图6)。


            图3　在多聚赖氨酸包被玻片上诱导分化7d后克隆细胞呈NeuN阳性(SABC-Cy3免疫荧光)。　×400
            Fig.3　NeuN(Nuclei antibody) positive cells after plating clones onto
            poly-L-Lysine coverslip 7 days in vitro (SABC-Cy3
            immuno-fluorescence).　×400


            图4　在多聚赖氨酸包被玻片上诱导分化7d后克隆细胞呈GFAP阳性(SABC-Cy3免疫荧光)。　×100
            Fig.4　GFAP positive cells after plating clones onto poly-L-lysine
            coverslip 7 days in vitro(SABC-Cy3 immuno-fluocence).　×100


            图5　在多聚赖氨酸包被玻片上诱导分化7d后克隆细胞呈CNP阳性(SABC-Cy3免疫荧光)。　×200
            Fig.5　CNP positive cells after plating clones onto poly-L-lysine
            coverslip 7 days in vitro(SABC-Cy3 immuno-fluorescence).　×200


            图6　免疫荧光双标染色显示NeuN(红色，SABC-Cy3染色)和GFAP(绿色，FITC染色)同时存在于同一克隆中。　×200
            Fig.6　NeuN(red) and GFAP (green) positive cells appeared in same
            clone (SABC-Cy3 and FITC immuno-fluorescence).　×200
            讨　论
            　　作为干细胞，它应具有以下属性：(1)自我维持和自我更新的能力；(2)具有多种分化潜能，具有分化为本系大部分类型细胞的能力；(3)增殖分裂能力；(4)这种自我更新和多分化潜能可以维持相当长的时间，甚至终生。(5)对损伤和疾病具有反应能力［8，9］。而作为神经干细胞，根据1997年Mckay［10］在Science上发表的文章认为，就是指具有分化为神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。祖细胞(neural
            progenitor)是相对与干细胞而言，其分化能力和自我维持、自我更新能力受到限制，仅具有单潜能或双潜能分化能力或其干细胞样特性只能维持较短的时间。而前体细胞(neural
            precursor)则是一个不太严格的术语，即某种前体细胞是在发育进程中较另一种细胞处于更早的阶段，可以统称干细胞和祖细胞［8～11］。总之，自我更新和多分化潜能是神经干细胞的两个基本属性。
            　　多分化潜能是神经干细胞的一个基本属性。在本实验中，我们使用免疫单标和双标染色证明了克隆细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，即多分化潜能，这与多家实验室的结果相同［4～6，9］。但事实上，即使是使用免疫三标染色也不能完全证明其多分化潜能，因为在混合细胞培养中单潜能克隆的细胞完全有可能离开原来的克隆并聚集到其他克隆而形成混杂的集落，更何况在体外诱导分化过程中细胞可以长入相邻的克隆。为确实证明神经干细胞的多分化潜能，本实验使用单个细胞形成的克隆连续传代得到大量克隆以证实单个细胞的多分化潜能，尚未见有类似报道。
            　　自我更新是神经干细胞的又一基本属性。所谓自我更新，指将干细胞样属性从亲代细胞传递到子代细胞，即在分裂增殖过程中子代细胞仍然维持干细胞属性［11］。本实验中分离的细胞群显然具有很强的自我更新能力，在连续传代过程中子代细胞依旧保持了亲代细胞的干细胞样属性，包括分裂增殖能力、多分化潜能和表达神经上皮干细胞蛋白(neuroepithelial
            stem cell
            protein,Nestin;下文将继续讨论)。而且，这种自我更新能力维持了相当长的时间，即使是在传代20代(＞5月)后仍然具有单细胞克隆能力，仍然表达神经上皮干细胞蛋白，仍可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。克隆形成实验表明1个克隆中大部分细胞不可避免死亡和分化(可能为祖细胞和成熟细胞)，但仍有10%～20%的细胞保持了干细胞样属性，表明这部分细胞实现了从亲代干细胞到子代干细胞的自我更新。
            　　能不断分裂增殖是神经干细胞的重要属性。在我们的实验中成年大鼠纹状体原代培养细胞及次代培养细胞具有克隆能力，在连续传代培养中依旧维持了这种克隆能力，为排除多细胞聚集产生类似集落的可能性，我们采用了单细胞克隆的方法证明单个细胞能够分裂增殖成为克隆。尽管Hulspas的实验未能得到单细胞克隆，但我们的实验结果和Reynolds等［4，9］的结果相同，即单细胞克隆是完全可能的［4～6，9，12］。同时，我们利用细胞在分裂增殖过程中可以吸收BrdU而合成自身核苷酸的原理来验证神经干细胞的分裂增殖能力，结果表明克隆的大部分细胞为分裂增殖产生的新生神经细胞。此外，我们尚使用神经上皮的特异性抗原-Nestin的抗体来证明我们所分离的细胞为胚胎早期细胞，因为Nestin的表达起始于神经板的形成，在神经迁移及神经分化开始后逐渐消失［13］。因此，本实验中分离的细胞群具有自我更新能力和多分化潜能，表达神经上皮干细胞蛋白，有很强的分裂增殖能力，具备了神经干细胞的基本属性，是中枢神经系统的干细胞。
            　　成体脑中神经干细胞的发现为神经发育研究和中枢神经功能重建提供了一条新的思路。从神经板的出现、神经管的形成到脑泡的发育都经历了从神经干细胞到祖细胞再到成熟神经细胞的发育过程，而神经干细胞和祖细胞的增殖、迁移与分化则无疑是其中最具代表性的环节。因此，研究神经干细胞和祖细胞的增殖、迁移和分化将为阐明神经系统发育的机制提供有力的证据［2，14］。其次，神经干细胞的发现为神经退行性疾病如帕金森病的功能重建带来了希望，无论是作为脑组织移值的供体，还是作为体内诱导分化的靶细胞，神经干细胞都为中枢神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径［2，14，15］。由于正常成年个体环绕侧脑室的室管膜下层、纹状体等地方仍存在神经干细胞，这些干细胞在正常情况下处于静息状态，如能将其在体内诱导分化以替代上述疾病中缺乏的神经细胞，则将为神经干细胞的应用提供广阔的应用前景［2，3］。尽管目前尚不能诱导神经干细胞特异性地、完全地分化为某种特定的神经元，但随着人们为胚胎发育机制认识的不断加深和新的细胞因子、化学信号的不断发现，必将推动上述研究的进一步深入。因此，对神经干细胞分化机制的研究将为在体诱导神经干细胞应用于中枢神经功能重建铺平道路。■
            基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770756)
            作者简介：刘仕勇(1973—)，男，四川长宁人，医学硕士，住院医师
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