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胚胎干细胞培养标准化操作规程fficeffice" />

一、细胞
二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态
培养基
细胞复苏
冻存细胞
明胶包被
细胞传代
三、体外分化
培养基
包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）
体外分化方法
四、移植细胞的准备
细胞
多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡
1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。
2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。
3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态
ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
培养基
ES:
配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
贮存液          
DMEM(高糖)          
马血清（HS）          
L-谷氨酰胺（200mM）          
MEM NEAA（10mM）          
HEPES（1M）          
β-巯基乙醇（55Mm）          
PEST          
ESGRO          
复苏细胞
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：
1．从液氮中取出一管细胞；
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
5．离心3分钟；
6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
8．孵育。
冻存细胞
冻存液90％HS和10％二甲基亚砜
步骤：
1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
2．用细胞刮刀收集细胞；
3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；
4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）
5．分装于冻存管内，每管1ml；6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。
明胶包被
准备500ml 0.1％明胶溶液
1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿

 

 

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