生物微核对环境污染的指示

一．实验目的  
 
通过实验，了解各种环境污染对生物遗传性质的改变，增强环境保护意识，同时掌握这种快速而简便的微核试验技术。  
 
二．实验原理：  
 
   环境的三致性，即指环境对生物的致畸、致癌、致突变性，是目前环境污染中最主要的问题。三致的根本在于致突变，致畸、致癌常常是致突变的结果。 
 
微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的1／20－1／5，这就是微核（micronucleus）。微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子的作用而加剧，而微核产生的数量又可与诱变因子剂量的强弱呈正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。各种类型的骨髓细胞中均能见到微核，但只有少量胞浆的有核细胞，其核是分叶而有突起的，这类分叶及突起常常被误认为是微核，容易造成计算误差。哺乳动物的红细胞，在成熟过程中将细胞核排出，成为无核细胞，而微核却留在细胞质中不被排出。这样，只要红细胞生成过程中出现过染色体断片，就能在成熟的红细胞内看到微核，一目了然，即使没有多少遗传学知识的人，稍加训练也能从事这方面的计数工作。染色体断裂实际上就是染色体的缺失。如果进行染色体畸变分析，首先要做染色核型分析（包括正常和异常的）。染色体数目多，形状小，则适于做核型分析的中间分裂相不易得到，而且核型分析时需要较好的遗传学知识，还需要较丰富的经验。与之比较，微核法是一种不需特殊试剂及设备，快速而简便的检测方法。 
 
蚕豆（vicia faba）根尖微核试验在1986年已被中国环保局列为一种环境生物测试的规范方法，它作为一种环境变异的检测手段，在我国不少地区的环保部门和医疗卫生系统中都有广泛的应用。蚕豆根尖微核实验与染色体畸变试验同样具有准确、快速、操作简便、有明显剂量—效应关系、适合大批量样品检测等特点。美国国家环保局也肯定了蚕豆根尖微核试验在环境突变性检测中的作用，对许多环境致癌物都作了标准化的试验，建立了庞大的数据库，并建议在全世界范围内推广。 
 
三．实验材料：  
 
1．器材  
 
光学显微镜、10ml试管、蚕豆发芽盒、洗瓶、镊子、载玻片、盖玻片、滤纸等。 
 
2．试剂及材料  
 
（1）环磷酰胺 
 
（2）蚕豆种子 
 
（3）卡诺氏固定液：由3：1的乙醇和冰醋酸配制； 
 
（4）水解分离液：盐酸与酒精1：1混合； 
 
（5）改良苯酚品红染液   
 
四．实验步骤： 
 
1  种子处理 
 
蚕豆种子洗净后,室温下用蒸馏水浸泡发芽24小时，然后移入铺有纱布的托盘内培养。当初生根长到2cm时，取发育良好的，大小与根长近似的幼根。 
 
将选好的蚕豆芽放入发芽盒中，使根尖完全浸入处理水样中，室温下培养48小时后，用蒸馏水洗根尖2次，蒸馏水恢复24小时，设蒸馏水处理为空白对照。本实验设两个处理，一为环磷酰胺药物处理，一为蒸馏水处理。 
 
2  固定 
 
借助于物理方法或化学药剂的作用，迅速透入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如：蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不易看清的结构。 
 
固定时在10ml试管内放入卡诺氏固定液约5毫升，用刀片或小剪刀切取经过处理的长约0.5—1厘米的根尖10—20条，放入试管内，用塞盖紧，在室温下固定2—24小时，固定液的用量为材料体积的15倍以上。 
 
3  水解分离 
 
      水解分离的作用是去除未固定的蛋白质, 同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。取处理好的材料，放在试管内加水解分离液2毫升，室温下处理8—20分钟，倒去水解分离液，再加入固定液2毫升，进行软化5min，软化对细胞壁起腐蚀作用。然后倒去固定液，用蒸馏水反复冲洗使材料呈白色微透明，以镊子柄能轻压碎好。 
 
4  染色压片（注意区分两种不同处理的材料） 
 
改良苯酚品红染色法：切取根尖分身组织放在载玻片上纵横切成几段，分别放在2片载玻片上，覆以载玻片，用镊子柄或铅笔头轻敲几下，再用拇指用力下压，注意不要使玻片移动，分开两玻片，各滴上1—2滴染液，20—30 分钟后加上盖玻片，注意不要有气泡产生，用吸水纸吸去多余染液。 
 
5  镜检 
 
低倍镜（10倍）镜检后，选择细胞分散均匀，细胞无损，染色良好的区域（也可在高倍镜下观察），每个处理观察100个细胞，记下微核数（两个处理分别记录）。 
 
五．注意事项：  
 
1．经过固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，换入70%酒精，0—4℃保存半年，再观察时换用固定液再处理一次，效果较好。 
 
2．环磷酰胺使用剂量过大，会导致细胞核变形，而非形成微核，故在实验中应多设浓度梯度处理或进行预实验。 
 
3．微核率的计算，以全班同学的微核数统一计算，每班每处理给出一个微核率。