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关于膜片钳的封接总结,有问题的请进

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endomorphin 发表于 2008-7-7 11:15:00 | 显示全部楼层 |阅读模式

刚刚注册不久,看到有很多朋友封接有问题。我做膜片钳的时间有一些年头了,封接方面还比较有把握。回想以前总是封不上的痛苦,很想和大家分享我的经验。

膜片钳封接需要注意的因素很多,但是最重要的就是细胞状态。如果状态好,真是一封一个准。一天做上十几个很轻松。

细胞状态好从取脑、切片子开始就很需要注意。

第一要素就是速度,从断头到把脑放进液体里一定要控制在1 Min之内,我一般是30-40 S。

第二就是温度很重要,脑组织取出来之后的放置的液体(准备液)一定要有冰。以前我是把液体放在冰水里,结果发现准备液的温度总是在7-8度,后来就把准备液冻起来,做得时候里面有很多冰蓉,这样总能在4度以下,这很重要。一定要有冰。切片子的时候也要时刻保持液体是有冰的状态,要经常加冰(当然是准备液冻出来的,可不是蒸馏水冻的冰)。切完片子后把片子捞到室温下通氧的孵育液里,也有人先放到35度的孵育液几分钟然后在进室温,我觉得差别不大。

第三就是pH值,许多许多的朋友都不注意这个问题,很多人认为通氧30分钟后就能饱和,可是在实践中发现pH变化很大,很快,如果想细胞状态好,以及记录时间长(我一般都能记1个小时以上),一定要注意这个问题。我是用1%的芬红(不能完全溶解,用前摇匀),1000 ml液体里加300 ul,通过芬红的颜色控制pH值,没有经验的朋友可以先测定pH值,就知道什么颜色代表什么pH值了。很重要的,大家用起来后就知道pH值的变化很大的。需要经常注意调节通氧量来调节。

其他的就是实验方法的问题了。我不多说了,大家都知道。

评分

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chenyi 发表于 2008-7-7 15:25:00 | 显示全部楼层

好帖就要顶,谢楼主!

这个bbs太沉闷……

bioguider 发表于 2008-7-7 21:43:00 | 显示全部楼层

这个太有用了,已经给加为精华。

 楼主| endomorphin 发表于 2008-7-8 21:44:00 | 显示全部楼层

感谢版主加精。

对了,上次忘了说液体的问题。液体我做的时候分为准备液,孵育液和灌流液。切片子是准备液,切完是孵育液。记录的时候是孵育液。Ca的浓度由低到高,Mg由高到低。都是为了使细胞状态达到最好。具体如下:

准备液:Dextrose=0.3964 g,

Ca2+/Mg2+=0.5 mM/6 mM

200 ml ACSF中加 0.1 ml 1 M Ca2+溶液和1.2 ml 1 M Mg2+溶液

 

孵育液+灌流液: Dextrose=1.5856 g

 

孵育液:Ca2+/Mg2+=2 mM/6 mM

200ml ACSF中加 0.4 ml 1M Ca2+溶液和1.2 ml 1M Mg2+溶液

 

灌流液:Ca2+/Mg2+=2.4 mM/1.2 mM

600ml ACSF中加 1.44 ml 1M Ca2+溶液和0.72 ml 1M Mg2+溶液

合起来是1000 ml,dextrose就是葡萄糖是1.982g.

最后想说的是,希望大家能多交流,心得能和更多的人分享。我看到了太多藏着掖着不愿意告诉别人的人了,总觉得很遗憾。如果每人知道一点却不愿意说只能是所有人都低水平徘徊。只有多交流才能共同促进,共同提高。

 楼主| endomorphin 发表于 2008-7-8 22:03:00 | 显示全部楼层
记录的时候是灌流液,写错了,sorry
bioguider 发表于 2008-7-9 02:26:00 | 显示全部楼层

论坛就是需要你这样的活跃分子。

thinker_jeff 发表于 2008-7-10 00:11:00 | 显示全部楼层
[em17][em17][em17]
LWY 发表于 2010-4-10 08:30:34 | 显示全部楼层
好帖子,我是刚开始做脑片,有好多问题请教啊
savanna7778 发表于 2011-1-7 20:39:05 | 显示全部楼层
感谢楼主的分享!顶了再看。
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