日志

抑制性消减杂交（SSH）服务

已有 563 次阅读2016-4-27 16:18

差减文库也称扣除文库，使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料(如不同基因处理细胞系或植物的近等基因系等)提取 mRNA (或反转录后合成 cDNA)，在一定条件下用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子( Driver )与含有目的基因的试验方( Tester )进行杂交，选择性的祛除两部分共同基因杂交形成的复合物，往往进行多次的杂交—祛除过程，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，并连接到载体形成文库。消减杂交是构建差减 cDNA 文库的核心，差减文库是否构建成功很大程度上决定于差减杂交的效率。差减杂交的方法主要有(1)羟基磷灰石柱层析法 (HAP)；(2)生物素标记、链亲和蛋白结合排除法；(3)限制性内切酶技术相结合的差减方法；(4)差减抑制杂交法 (SSH)；(5)磁珠介导的差减法 (MAST)，其中 SSH 法最为常用。
抑制性消减杂交技术 (Suppression Subtractive Hybridization，SSH) 是 DIATCHENKO 等人于1996 年依据消减杂交和抑制 PCR 发展出来的一种分离差异表达基因的新方法，主要用于分离两种细胞或两种组织的细胞中的差异表达基因。它主要是利用抑制 PCR 对差减杂交后丰度一致的目的材料中两端连有不同接头的差异表达片段进行指数扩增，而两端连接上同一接头的同源双链片段仅呈线形扩增，从而达到富集差异表达基因的目的。因此应用该技术能够对两个有差异表达的材料(细胞或组织)高、中、低丰度目的基因都进行有效、快速、简便克隆。近年来已成功应用于植物发育、肿瘤与疾病、以及外界因子诱导组织细胞中相关的应答基因的分析和克隆。

特点

l 快速获取两个不同生物材料中差异表达基因

l 显著增加了获得低丰度表达差异的cDNA的概率，简化了消减文库的分析

l 灵敏度高，假阳性率低

原理

抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)是依据消减杂交和抑制PCR发展出来的一种分离差异表达基因的新方法，主要用于分离两种细胞或两种组织的细胞中的差异表达基因。它主要是利用抑制PCR对差减杂交后丰度一致的目的材料中两端连有不同接头的差异表达片段进行指数扩增，而两端连接上同一接头的同源双链片段仅呈线形扩增，从而达到富集差异表达基因的目的。

服务流程

1) 以约2ug的mRNA为模板合成cDNA(双链cDNA)

2) 对双链cDNA进行酶切，酶切后产物（Tester）与接头进行偶联

3) Tester与Driver进行消减杂交

4) 进行抑制性PCR反应

5) PCR产物的纯化

6) 与T载体连接，连接产物转化感受态细胞DH10B

7) 随机挑取24个克隆子并抽提质粒，酶切后电泳以检测含插入片段的克隆子比例

客户提供

样品需求量：200～400mg组织或10^7细胞

我们提供

提供实验报告及构建于T载体的差异文库（涂布后的平板）；48个（双向）克隆的PCR鉴定。