如何 阅读 质粒 图谱

如何 阅 读 质 粒 图 谱
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素
复制起始位点 Oril 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始
点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
＃抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+l ,Kan+
＃多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 l
＃P/E 启动子/增强子 l
＃Termsl 终止信号
＃加 poly（A）信号 l 可以起到稳定 mRNA 作用
二、如何阅读质粒图谱
第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解 β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶使 G418（长那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素 β 失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定
能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再 看外源 DNA 插入片段大小。质 粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。
一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信
号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即
成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号
＃启动子－促进 DNA 转录的 DNA 顺序，这 个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的
上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本
身不被转录。l
＃增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因
转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或
下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。l
＃核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位
点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。l
＃转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个
AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同
构成 poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，
此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号。
l 回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，
那其实是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链 DNA，它的启动子等在其中一条链上，
而它的抗性基因在另一条链上.
三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写）
1. 什么是载体

即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细
胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工
具就叫做载体（vector）。
P.S.基因工程所用的 vector 实际上是 DNA 分子，是用来携带目的基因片段进入受体细
胞的 DNA
2. 载体的分类
＃按功能分成：
（1）克隆载体都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它
是用来克隆和扩增 DNA 片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注
意是不是使用的严谨行载体）
（2）表达载体具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录/翻译所必需的
DNA 顺序的载体。
＃按进入受体细胞类型分：（1）原核载体 （2）真核载体（3）穿梭载体（shuttle vector）
指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之
间）.
P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物 2 个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。
3. 基因工程载体的 3 个特点：
（一）都能独立自主的复制：载体 DNA 分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，
如 MCS，插在其中的外源 DNA 片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的
正常成分一样。
（二）都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细
胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只 有携带这些抗性基因的载体分子的受体细
胞才能存活。
（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。
4. 载体的选择和制备：选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的
限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述 3 点：
【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：
－－－（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质
粒。
－－－（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
－－－（3）对原核表达载体应该注意 3 点：
－－－－－－①选择合适的启动子及相应的受体菌；
－－－－－－②用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位；
－－－－－－③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易
于链接，不产生阅读框架错位。
选用质粒（最常用）做载体的 4 点要求：
①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也
有大载体）；
②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10 个以上的拷贝，而严谨型质粒
<10 个。
③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行
切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。
质粒载体 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或
细胞共生的遗传成分。其特点如下：
① 是染色质外的双链共价闭合环形 DNA （ covalently closed circuar
DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在 2300kb
之间，＜15kb 的小
质粒比较容易分离纯化，＞15kb 的大质粒则不易提取。
②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。一般质粒 DNA
复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严
紧控制（stringent control）型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞
中只有 1 个到十几个拷贝；另一类是松弛控制（relaxed control）型质粒，其复制宿主
不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。每个质粒 DNA 上都有复制的起点，只有 ori
能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不 同质粒复制控制状况主
要与复制起点的序列结构相关。有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质 DNA 中，随宿
主 DNA 复制，称为附加体，例如细菌的性质粒就是一种附加体，它可以质粒形式存在，
也能整合入细菌的 DNA，又能从细菌染色质 DNA 上切下来。F 因子携带基因编码的蛋
白质能使两个细菌间形成纤毛状细管连接的接合（conjugation），通过这细管遗传物质
可在两个细菌间传递。
③质粒对宿主生存并不是必需的。这点不同于线粒体，线粒体 DNA 也是环状双
链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的
一部分，质 粒也往往有其表型，其 表现不是宿主生存所必需的，但 也不妨碍宿主的生存。
某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的
质粒带有抗药性基因，如 编码合成能分解破坏四环素、氯 霉素、氨 芐表霉素等的酶基因，
这种质粒称为抗药性质粒，又称 R 质粒，带有 R 质粒的细菌就能在相应的抗生素存在
生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。