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都说RNAi很容易降解,转染效率很低,是真的吗?

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engreen 发表于 2016-8-22 16:59:44 | 显示全部楼层 |阅读模式

RNAi就是利用降解双链RNA的酶系统,人工引入一段和目标RNA互补的序列,这样,在细胞内形成双链RNA,诱发降解机制,使目标RNA降解,无法被进一步翻译。

在转染过程中,有人就在担心,dsRNA的稳定性是相对于单链RNA而言的!RNA怎么办?

RNAi中,标准的非修饰的siRNA确实容易降解,这不仅在保存过程中,而且在转染过程中。对siRNA的降解,可以合成修饰的双链siRNA,以提高合成中的稳定性,使用合成好的siRNA。

不管是什么样的RNA实验,最基本的一点就是要严防RNase!尽量严格做到不要受RNA酶的污染。可以用高温变性、DEPC等处理使RNase失活就好了!
所以还是勤快点的好!

对转染来说,因为要接触血清,培养基以及细胞内酶的作用。这时,好的转染试剂作用就显现出来了。要做到在血清中游离时,保护siRNA不受培养基中酶和蛋白 的降解、吸附等影响,同时在进入细胞后不被溶酶体降解,并能释放到细胞质中。好的转染策略还不仅有保护的作用,更重要的是浓缩siRNA,不将细胞外的其 他成分,特别是毒性成分,如抗生素、过多的蛋白带入细胞,以避免细胞产生毒性反应,毒性对RNAi实验来说,影响非常大。

做RNAi干扰用siRNA还是shRNA进行转染需要根据您的试验综合考虑。

1.选择siRNA的优缺点

选择siRNA只能瞬时转染,作用周期短,但是siRNA相对与shRNA操作简便,试验周期短,转染效率一般优于shRNA,主要是优于siRNA分子特 性决定的,siRNA转染优化一般使用荧光标记的siRNA,在荧光倒置显微镜下观察荧光的强弱以及分布。荧光特异性比较弱。

2.选择shRNA的优缺点

选择shRNA可以瞬转也可以稳定转染,作用周期较长,需要构建载体,操作稍微复杂与siRNA,试验周期较长,转染效率与您的转染手段以及细胞类型有关。一般用GFP或者Luc检测转染效率。

不管是原代细胞还是别的类型细胞这两种方法都是可以选择,根据您的试验需要进行选择。不论siRNA还是shRNA做原代转染,需要优化转染条件,特别转染试剂选择以及转染手段上需要经验。如果转染效率还是比较低的话可以选择用流式细胞仪进行分选。

文章来源:英格恩技术的官方博客,原文详见:http://www.engreen.cn/2015/08/rnai-tansfection-123

都说RNAi很容易降解,转染效率很低,是真的吗?
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