细胞培养实验中常见的问题

1. 关于细胞培养的培养基和血清
每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基， 若骤然更换培养基细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
2.        血清的保存和解冻
血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。 将血清从冷冻冰箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。

3. 培养细胞时关于CO2的使用
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。

4. Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有之间的功能差别

HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

5. 悬浮性细胞传代的处理

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞的培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。欲回收动物细胞，其离心速率一般为1,000rpm)，5 - 10 分钟，过高转速将造成细胞死亡。

6. 如何避免细胞污染

细胞污染的种类可分成细菌、霉菌、病毒和支原体。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、使用遭受污染的血清和细胞等。应该严格无菌操作技术，建立清洁的环境，使用正规渠道的细胞来源和培养基等来减少污染的机会。

7.细胞发生污染时的处理方法
细胞遭受细菌真菌污染容易观察到，大多数遭受支原体污染的细胞株，除极有经验之专家外， 无法以其外观分辨。苏州先达基因细胞支原体快速检测试剂盒，操作简单，20min出结果；结果准确，特异性强，可检测超过130种支原体；高灵敏度，可低至数十拷贝。


细胞遭受支原体污染最直接的方法是灭菌后丢弃掉，以避免污染其它细胞株。如果培养的细胞非常重要，研究者可试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可减轻细胞的污染程度。
8.支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染可影响所有细胞的生长参数， 代谢及研究数据的准确性。所以进行实验前，必须确认细胞是没有遭受支原体污染的，这样的实验结果和数据才有意义。









9.胰蛋白酶中加入EDTA的目的
二价离子会抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

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