Treg细胞常用的分子标记与检测方案-北京百奥思科生物分享

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Treg细胞概述

天然CD4+ CD25+ 调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类具有免疫抑制作用的T细胞，约占外周血单个核细胞（PBMC）2%～5%，约占外周CD4+T细胞的5～10%。该类细胞以“主动”的方式参与免疫应答/免疫耐受的调控，不仅参与自身免疫耐受调节，而且在肿瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。

02

Treg细胞的常用的分子标记

抗原分子

表达及其功能

CD4+

与MHC II类分子结合；主要表达在Th细胞上

CD25+

表达于大部分Treg细胞上

CD3+

表达于所有T细胞上，是TCR的组成部分

GITR

阴性标记分子

CTLA-4

结合CD80/CD86

CCR7

介导Treg细胞的迁移

FOXP3

是Treg细胞发育成熟和发挥功能的必要因素；是目前Treg细胞最敏感的标记

CD127

CD127是IL-7受体一部分，是新发现的Treg细胞标记分子

①CD25：研究表明，多种T细胞分子抗原可以参与Treg细胞的特异性功能效应。传统鉴定Treg细胞主要是通过CD4和CD25来标记。但这种方式并不完全准确。

②FOXP3：目前，Foxp3(forkhead box P3，Scurfin)是目前公认的Treg细胞的最敏感的标志。

它的表达及功能与调节性T细胞(regulatory T cells，TR细胞)密切相关。

③CD127：最近发现通过表达CD4，CD25和传导信号FoxP3来定义调节性T细胞时，在一类特殊的细胞群体时会出现问题。IL-7受体（CD127）在外周血CD4+T的一个亚群中会下调表达。我们证实这些细胞FoxP3阳性，且这群细胞包括那些CD25弱阳性或阴性群体。联CD4，CD25和CD127的联合使用可得到高纯度的调节性T细胞，比以前的通过其他标志物来区分方法显著提高。

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FOXP3流式检测方法

（1）实验材料

实验设备

流式上样管

混匀振荡器

离心机

移液器、Tips

流式细胞仪

所需试剂

细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂（CD4、CD25或CD8等）

FOXP3荧光标记抗体

溶血素：（eBioscience目录号00-4333）用于裂解红细胞

淋巴细胞分离液：若样品为人的全血，建议先用分离液分离出单个核细胞后再做后续检测

固定剂和破膜剂：（eBioscience FOXP3检测专用试剂，目录号为00-5521或00-5523；在FOXP3染色前，将其中的Fixation/Permeabilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent以1：3的比例混合，配制好的溶液保存时间不要超过一天）

其他试剂：Flow Cytometry Staining Buffer（00-4222）或PBS，Permeabilization Buffer（Cat.No 00-8333）等

（2）实验操作步骤

按照流式样品要求制备单细胞悬液。

按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。

加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品最长可以四度固定18小时）。

每管加2ml 1×permeabilization buffer。

300g 室温离心5min,弃上清。

2ml 1×permeabilization buffer重悬细胞。

300g 室温离心5min,弃上清。

加100ul 1×permeabilization buffer 重悬细胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞内抗原抗体），室温避光孵育20min。

2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室温离心5min,弃上清。

加2ml 流式染色液，300g 室温离心5min,弃上清。

适量流式染色液重悬，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。

注：在染胞内或胞核内的因子时，要对细胞进行固定和破膜，因此，与活细胞相比，在形态上会有一定变化，因此必须对所有细胞样本进行固定和破膜；若对Blank和染色细胞没做固定和破膜，在FSC/SSC图中对固定和破膜的样品细胞圈门时需要做一定调整。
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