【实验方法】明胶酶谱法检测 MMP 活性-百奥思科
细胞外基质（ extracellular matrix ， ECM ）是由大分子构成的错综复杂的网络。为细胞的生存及活动提供适宜的场所，并通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可以降解细胞外基质成份，需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子，是一组具有许多共同生化性质的可降解细胞外基质的酶。基质金属蛋白酶2（MMP2）主要降解IV型胶原，基质金属蛋白酶9（MMP9）可以降解弹性蛋白、胶原蛋白、明胶和纤维蛋白等细胞外基质的成分。基质金属蛋白酶的失调是多种疾病发生、发展的重要机制之一。
明胶酶谱实验可以检测MMP2和MMP9的活性，是分子生物学的常用实验技术之一。先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
实验流程如下：
图片
No.1
样品制备
组织或细胞的蛋白样品制备可用常规的方法，但需注意蛋白裂解液中不能加入EDTA，因为EDTA是金属离子螯合剂，可以络合Zn2+，抑制MMP的活性；也不能加入β-巯基乙醇或DTT，因为会导致蛋白的二硫键被打开，蛋白不能复性。推荐用PBS或Tris缓冲液（pH7.5）作为蛋白提取的缓冲液，可以加入0.5%的PMSF。
No.2
SDS-PAGE
1)SDS-PAGE 凝胶配制
_
10%分离胶
5%浓缩胶
总体积
10mL
6mL
30%丙烯酰胺
2.0mL
0.75mL
1.5M Tris-cl (PH 8.8)
2.5mL
/
1.0M Tris-cl (PH 6.8)
/
0.76mL
10%SDS
0.1mL
0.006μl
10%AP
0.1mL
0.006μl
TEMED
8μl
0.006μl
明胶（10mg/mL）
1.0mL
/
超纯水
4.5mL
4.5mL
明胶母液配制后可在4℃保存，最好不超过1周。
2)电泳
4℃、常规电泳即可，可以适当延长电泳时间，至溴酚蓝完全出胶。上样量一般为50μg，可根据实验的具体情况和预实验结果调整。
注
意
①上样缓冲液中不能加入β-巯基乙醇或DTT，原因同上。
②样品与上样缓冲液混合后直接上样，样品不要煮沸，高温会导致蛋白不可逆的失活。
No.3
反应和显色
1)将凝胶置于洗脱液（2.5% Triton X-100，50mM Tris-HCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，pH7. 6）中振荡洗脱2次,每次40分钟。
2)漂洗液（50mM Tris-HC，5mM CaCl2，1μM ZnCl2）漂洗2次,每次20分钟。
3)凝胶置于孵育液（50mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，10mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.02% Brij-35）中37℃ 孵育42-48小时。
4)染色液（考马斯亮蓝染色液）染色3小时。
染色液配方表
甲醇
乙酸
5%浓缩胶
30%
10%
0.5%
5)脱色液A、B、C分别脱色（脱色液配方及时间见附表）。
脱色液配方及脱色时间
_
甲醇
乙酸
脱色时间
A
30%
10%
0.5小时
B
20%
10%
1小时
C
10%
5%
2小时
脱色时间可以根据观察到的脱色效果调整。
QQ：391956309 TEL:137-1827-9886
页:
[1]