【实验方法】明胶酶谱法检测 MMP 活性-百奥思科

细胞外基质（ extracellular matrix ， ECM ）是由大分子构成的错综复杂的网络。为细胞的生存及活动提供适宜的场所，并通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可以降解细胞外基质成份，需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子，是一组具有许多共同生化性质的可降解细胞外基质的酶。基质金属蛋白酶2（MMP2）主要降解IV型胶原，基质金属蛋白酶9（MMP9）可以降解弹性蛋白、胶原蛋白、明胶和纤维蛋白等细胞外基质的成分。基质金属蛋白酶的失调是多种疾病发生、发展的重要机制之一。

明胶酶谱实验可以检测MMP2和MMP9的活性，是分子生物学的常用实验技术之一。先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

实验流程如下：


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No.1

样品制备

组织或细胞的蛋白样品制备可用常规的方法，但需注意蛋白裂解液中不能加入EDTA，因为EDTA是金属离子螯合剂，可以络合Zn2+，抑制MMP的活性；也不能加入β-巯基乙醇或DTT，因为会导致蛋白的二硫键被打开，蛋白不能复性。推荐用PBS或Tris缓冲液（pH7.5）作为蛋白提取的缓冲液，可以加入0.5%的PMSF。

No.2

SDS-PAGE

1)SDS-PAGE 凝胶配制



_
10%分离胶

5%浓缩胶

总体积

10mL

6mL

30%丙烯酰胺

2.0mL

0.75mL

1.5M Tris-cl (PH 8.8)

2.5mL

/

1.0M Tris-cl (PH 6.8)

/

0.76mL

10%SDS

0.1mL

0.006μl

10%AP

0.1mL

0.006μl

TEMED

8μl

0.006μl

明胶（10mg/mL）

1.0mL

/

超纯水

4.5mL

4.5mL

明胶母液配制后可在4℃保存，最好不超过1周。

2)电泳

4℃、常规电泳即可，可以适当延长电泳时间，至溴酚蓝完全出胶。上样量一般为50μg，可根据实验的具体情况和预实验结果调整。

注

意

①上样缓冲液中不能加入β-巯基乙醇或DTT，原因同上。

②样品与上样缓冲液混合后直接上样，样品不要煮沸，高温会导致蛋白不可逆的失活。

No.3

反应和显色

1)将凝胶置于洗脱液（2.5% Triton X-100，50mM Tris-HCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，pH7. 6）中振荡洗脱2次,每次40分钟。

2)漂洗液（50mM Tris-HC，5mM CaCl2，1μM ZnCl2）漂洗2次,每次20分钟。

3)凝胶置于孵育液（50mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，10mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.02% Brij-35）中37℃ 孵育42-48小时。

4)染色液（考马斯亮蓝染色液）染色3小时。

染色液配方表

甲醇

乙酸

5%浓缩胶

30%

10%

0.5%

5)脱色液A、B、C分别脱色（脱色液配方及时间见附表）。

脱色液配方及脱色时间



_
甲醇

乙酸

脱色时间

A

30%

10%

0.5小时

B

20%

10%

1小时

C

10%

5%

2小时

脱色时间可以根据观察到的脱色效果调整。
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