[转帖]免疫印迹技术服务(western blot)

免疫印迹技术服务(western blot)

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(western blot)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。western blot是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹(western blot)具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹(western blot)常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

闪晶生物为您提供全套免疫印迹(western blot)技术服务和相关的试剂耗材。主要实验步骤如下：

• 蛋白质抽提
  • 实验对象为组织样品，取适量（250~500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
  • 实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。

2. 蛋白质定量：按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE):将准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4. 蛋白质转移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5. western blot膜的封闭和抗体孵育

• 膜在5％脱脂奶粉溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
• 封闭过的膜加入一抗室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
• 加入HRP标记的二抗体以结合一抗，室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。

6. western blot结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件，并用GIS1000分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
7. western blot数据分析：目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
8. 提供实验报告，包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关数据。
更详细的操作说明

  Western Blot操作规程

western blot费用：每张膜上做一种目的蛋白和相应的内参蛋白。每张膜上可以做8个样品。每张膜的费用是：1500.00元。一抗另计，其它试剂免费，一抗订购时间约为3周。乘车路线：火车站坐1号地铁到终点站，然后换5号地铁坐到北桥站即可。
时间：约2－3周。
联系：master@shinegene.org.cn shinegene@vip.163.com 电话：021-54460831-11

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Western Blot相关的试剂和耗材

产　品　名　称	包　装	单　价(RMB)
Trypsin-EDTA	0.25%,100ml	150.00
蛋白裂解液（蛋白提取液）	10ml	60.00
PMSF	100mM 10ml	86.00
40% Acr/Bis (37.5:1)	100ml	100.00
40% Acr/Bis (29:1)	100ml	100.00
40% Acr/Bis (19:1)	100ml	100.00
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液	2x,1ml	28.00
SDS-PAGE电泳缓冲液	10x,500ml	100.00
蛋白胶快速染色液	100ml	120.00
蛋白转移缓冲液	10x,500ml	100.00
可逆型转移膜染色液	100ml	120.00
Tris-HCl Buffer,PH6.8(配浓缩胶）	0.5M, 250ml	100.00
Tris-HCl Buffer,PH8.8(配分离胶）	1.5M, 250ml	100.00
PBS buffer	20x,500ml	100.00
PBST buffer	20x,500ml	100.00
TBST buffer	20x,500ml	100.00
TBS buffer	20x,500ml	100.00
SDS	10%,100ml	100.00
洗脱抗体缓冲液(膜再生液）	100ml	100.00
二抗-HRP	0.2mg	175.00
预染Marker（20~120kDa）	250ul	200.00
ECL化学发光试剂	25ml	200.00
显影液	250ml	45.00
定影液	250ml	45.00
硝酸纤维素膜NC膜	15cm*20cm	60.00
PVDF膜	13.5cm*15cm	80.00
3MM滤纸	27cm*1M	40.00
X线暗盒	5*7int.	600.00
柯达X光胶片	5*7int. 100/pk	200.00
乳胶手套	100/pk	65.00
PE薄膜手套	100/pk	5.00

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各种标签抗体
Mouse Anti His-tag (monoclonal)
抗His标签单抗
 

Cat. No.	Price
A00088-100 ug	￥1870.00

本品为：亲和纯化的小鼠Anti-His Tag单克隆抗体，其免疫原是：6× His 合成肽；
抗体亚型是：Mouse IgG2b。
本品为冰冻液体，浓度为1mg/ml （溶于PBS, pH 7.4，含有0.05% 叠氮化钠。）
本品能特异识别细胞中His-tagged的重组蛋白或在细胞中过表达的His-tagged 的蛋白。
本品特异性和敏感性极高，不与细菌、酵母或哺乳动物来源蛋白发生交叉反应，可检测1.0 ng His标签融合蛋白。
应用：
Western blot (1:1000)
免疫沉淀法和免疫染色法(1:200)。
稳定性和储存：
-20oC稳定12个月。
打开盖子之前，尽可能离心原装管。
分装，避免反复冻融。
分装样在4℃下可保存三个月。

Mouse Anti GST-tag (monoclonal)
抗GST标签单抗

Cat. No.	Price
A00014-200 ug	￥1080.00

本品为：亲和纯化的小鼠单克隆抗体，其免疫原是：GST（谷光甘肽-S-转移酶，glutathione-S-transferase）多肽，抗体亚型是：小鼠IgG2b。
本品为冰冻液体，浓度为1 mg/ml（溶于pH 7.4，含0.02%叠氮钠的PBS）。
本品能特异识别GST蛋白和带有GST标签(GST-tagged)的融合蛋白。
应用：
ELISA：（1:10000~100000，即： 0.01~0.1 μg/ml）
Western blot (1:1000，即：1.0 μg/ml)
稳定性和储存：
本品稳定性强，冻干可以保存十年；
溶液4℃可保持一个月；
请避免反复冻融；分装并保存于-20℃或-80℃。
打开盖子之前，尽可能离心原装管。

兔抗GST标签抗体：
Mouse Anti Myc-tag (monoclonal)

Code	Name	Size	Price
A00097	Rabbit Anti GST-tag (polyclonal)	100 ug	￥560.00
		200 ug	￥1050.00
A00130	Rabbit Anti GST-tag [HRP] (polyclonal)	100 ug	￥980.00

Mouse Anti Myc-tag (monoclonal)
   
抗Myc标签单抗
 

Cat. No.	Price
A00091-100 ug	￥1870.00

本品为：亲和纯化的小鼠单克隆抗体，其免疫原是：来自偶联至KLH的 410-419 (EQKLISEEDL)残基相对应的合成肽，抗体亚型是：Mouse IgG1。
本品为冰冻液体，浓度为1 mg/ml（溶于pH 7.4，含0.02%叠氮钠的PBS）。
本品能特异识别包含融合至靶蛋白的氨基端或羧基端的Myc抗原决定簇的过量表达的蛋白。

应用：
Western blot (1:1000), 免疫沉淀法和免疫染色法(1:200).
稳定性和储存：
–20℃保存，稳定期为一年。
请避免反复冻融；
分装样在4℃下可保存三个月。
打开盖子之前，尽可能离心原装管。

Mouse Anti HA-tag (monoclonal)
抗HA标签单抗
 

Cat. No.	Price
A00087-100 ug	￥1870.00

本品为：亲和纯化的小鼠单克隆抗体，其免疫原是：来自偶联至KLH的流感血凝素抗原决定簇(EQKLISEEDL)的合成肽，抗体亚型是：Mouse IgG3。
本品为冰冻液体，浓度为1 mg/ml（溶于pH 7.4，含0.02%叠氮钠的PBS）。
本品能特异识别细胞中过量表达的HA-tagged标记的融合蛋白。

应用：
Western blot (1:1000), 免疫沉淀法和免疫染色法(1:200).
稳定性和储存：
–20℃保存，稳定期为一年。
请避免反复冻融；
分装样在4℃下可保存三个月。
打开盖子之前，尽可能离心原装管。

其他标签蛋白：

Code	Name	Size	Price
M0001	GST lysates	100 ug	￥786.50
M0002	Myc lysates	100 ug	￥786.50
M0003	His lysates	100 ug	￥786.50
M0004	HA lysates	100 ug	￥786.50
M0005	Flag lysates	100 ug	￥786.50
M0100	Mutiple Tag Cell Lysate	200 ug	￥572.00

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