Western blot 试剂准备

Western Blot试剂的准备


1. 30%储备胶溶液：
丙烯酰胺（Acr）             29.0g
　　　　　　　　　　　亚甲双丙烯酰胺（Bis）        1.0g
　
混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。


2. 4×分离胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl  PH 8.8）   Tris  18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。


3. 4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl  PH 6. 8）    Tris  12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。


4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。


5. 5×电泳缓冲液（PH 8.3）：     Tris       15.2g
                                 甘氨酸    94g  
                                 ddH2O     定容到1000ml
                                 SDS       5g
　　先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。


6. 10%过硫酸铵（AP）：0.1g  AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。


7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液
　　　0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8)  2ml
　　　10%SDS                  4 ml
　　　β-巯基乙醇               1ml
　　　甘油                      2ml
　　　1%溴芬蓝                 1ml
　　　置4℃避光保存


8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用


9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：
即1×SDS-PAGE


10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ：      NaCl              8.5g
　　　　　　　　　　　　　　　(12H2O)Na2HPO4     2.9011g
　　　　　　　　　　　　　　　(2H2O)NH2PO4         0.24g
　　　　　　　　　　　　　加ddH2O定容至       1000ml


11. 封闭液:                          1×PBS中加入                30ml
　　　　　　　　　　　5%（V/V）脱脂奶粉           1.5g
　　　　　　　0.02%叠氮钠                0.006g
　　　　　　　0.05%Tween-20              0.015g


12. 漂洗液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS溶液
　　每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-20


13. 水饱和正丁醇：
正丁醇    50 ml
　　　　　　　　　ddH2O      5 ml     加入瓶中震荡，使结合，存于室温。
　　用时取上面一相加在凝胶上面。


14. 考马斯亮蓝染色法试剂：一般用G250考马斯亮蓝（蛋白定量专用）
染色液： 90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g，用Whatman 1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。（染色液多次回收利用）
　　　　　　　　　脱色液：90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液


15. 丽春红S染色色法试剂：2%乙酸，
　　　　　　　　　　　　　0.5%丽春红的水溶液
　　脱色液：TBS


16. Aprotinin:为一58氨基碱性多肽，经反复冻融后，会发生集聚，储存液应分装成小份，保存于-20度，每一小份用后应予废弃。


17. PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF通常配成10mmol/L浓度储液（1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中）保存于-20度。


18. 显色液：联苯胺显色液（DAB）
　　　　　DAB                 2ml
　　　　　10%H2O2                   60μl
　　　　　PBS(0.1mol/L PH6.4)   10ml


19. 三去污裂解缓冲液
           0.5mol/L Tris-HCl(PH 8.0)          0.785g/100ml
           0.15mol/L  NaCl                    0.8775 g/100ml
           0.02%叠氮钠                       0.02 g/100ml
           0.1%SDS                           0.1 g/100ml



超级详细配方：

SDS-PAGE、蛋白转印、Western Blot试剂配制


(***整理，2004.9.6)






1.5 mol/L Tris (PH8.8)


1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。


2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。


3．用浓盐酸调节pH值至8.8。


4．定容至1L.


5．高压灭菌后，室温保存。


注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。


（参照kara公司Catalog-N1）




1 mol/L Tris (PH6.8)


1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。


2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。


3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。

pH值
浓HCl

6.8


7.4
约70 ml

7.6
约60 ml

8.0
约42 ml


4．定容至1L.


5．高压灭菌后，室温保存。


注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。

我也想了解，谢谢发帖的人