核酸相位测定及结晶的新突破

核酸与蛋白核酸复合物的研究和三维结构的测定已成为极其重要的疾病分子机理研究和药物发现研究的新领域。对这些大分子结构和它们的配体的研究， X射线晶体学是最直接和最有力的测定方法之一。然而，常规的重金属原子取代衍生物相位测定方法（X射线相位测定方法是X射线晶体学研究领域长期存在的两个难题之一）由于其自身的缺陷，在很大程度上阻碍了新的结构和折叠结构的测定。另外一个难题是结晶方法。到目前为止，在核酸结晶方面还没有一个合理的解决方案。因此，建立一个新的方法和工作平台对促进核酸和蛋白核酸复合物的X射线晶体学发展，特别是大规模制备结晶等工作均具有巨大的价值。

最近我们的研究小组，成功地发明了一种新的衍生物制备方法（其原理是通过硒取代核酸分子中的氧原子），并且已通过多次实验确认。我们的研究是基于我们的假设：由于氧、硒均处在元素周期表中的同一族（VIA），因此,硒可稳定地取代核酸中的氧原子，而不产生明显的结构变化。硒核酸衍生物将为核酸、蛋白核酸复合物以及类似药物的小分子核酸复合物的晶体结构测定提供相位信息。到目前为止，已经通过大量的试验成功地证明，我们的硒核酸衍生物可用于解决相位测定难题。同时发现，硒核酸衍生物也可以在很大程度上促进核酸的结晶。这些独特的功能对于实现核酸和蛋白核酸复合物（如非编码RNA）的高通量结构测定，满足制药和生物技术行业对新的潜在药物靶点(核酸和蛋白核酸复合物)的结构生物学研究的需求，具有非常高的研究和商业应用价值。

使用的硒代亚磷酰胺核苷或硒代核苷三磷酸(核酸砌块)均可用化学或酶学方法进行合成。我们的研究也表明，硒核酸衍生物不会造成重大的结构性变化。因此，我们进一步假设，将多个硒原子引入到DNA或RNA中,仍然能够保持其天然结构和功能特性。因此，我们开发的这一独特技术将对解决困扰X射线晶体学的两大难题提供了一个合理的解决方案。我们将利用这一技术开展核酸和蛋白核酸复合物的相位测定及结晶制备，尤其是用于高通量结晶制备、3D结构测定及新药研发。

DNA-蛋白复合物和RNA-蛋白复合物的三维结构的高分辨率测定工作，对于人们在分子水平上了解生物系统的原理其价值是不可估量的。 X射线晶体学是测定这些大分子结构最直接、最有力的方法。然而，如上所述，制约其快速发展的瓶颈是其难以结晶和相位测定。目前制备DNA和RNA衍生物的方法是重原子浸泡和共结晶法，但实验证明其对核酸类物质要比对蛋白质类物质困难很多。原因可能是核酸分子上缺乏对金属离子的特殊结合位点。另外，射线稳定性差和结构变化也是制约卤素衍生物(如溴、碘)使用的原因。以前传统方法是用5–溴脱氧尿嘧啶（胸腺嘧啶衍生物）制备DNA衍生物; 用5–溴尿嘧啶（胸腺嘧啶衍生物）制备RNA衍生物，以方便非常规散射法（MAD）进行3D结构测定。但是，卤素衍生物对天然结构可能引起变化。卤素衍生物也可能导致其分子骨架结构破坏，亲水性发生变化或其它结构变化。此外，卤素衍生物如溴衍生物是光敏感性物质，长期接触X射线或紫外线可能导致分子分解。

最近，我们通过用硒原子取代核酸中的氧原子,已经成功地开发了一种新的硒核酸衍生物。与传统的卤素（Br或I）取代氧不同，硒能够取代核酸中多个位置中的氧原子，如核糖上2'–、3'–、5'–的氧，呋喃环上的氧，非桥键磷酸基上的氧。取代位置的多种选择，能够尽量避免修饰所造成的结构和功能上的变化。我们从2'–硒取代DNA结构图上发现，2'–硒呋喃糖显示出在3'–端有一个糖皱褶，这与DNA和RNA的A处的糖皱褶一致。另外，2'–甲基硒基团处在折叠部位的尖端。

我们发现，溴衍生物改变了原来位置上的分子骨架扭转角度和水溶性。不管是天然的还是溴取代衍生物都需至少几个星期的时间才能形成合适大小的晶体，而硒衍生DNA则可在一夜之间生成高衍射率的晶体，这说明硒衍生物有利于晶体的生长。[9,10]此外，硒衍生物DNA所需要的结晶条件要求更宽泛（缓冲液缓冲区范围更广），一般来说晶体生长速率更快。我们观察到，一般在数天甚至一夜的时间硒取代衍生物的晶体即可形成，而相应的天然DNA的晶体需要两到三个月时间。我们的试验结果还表明，硒取代衍生物更有利于核酸结构的测定，并且能够促进高品质的晶体生长。总之，硒取代核酸衍生物可以完全取代传统的溴取代衍生物法，具有无比的优越性。利用硒取代核酸特殊位置上的氧原子将极大地促进核酸、蛋白核酸复合物和小分子配体的X射线晶体结构研究。

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