人脑的奥秘能否由人脑自身揭示zt

医学与哲学2002 年3 月第23 卷第3 期总第250 期

人脑的奥秘能否由人脑自身揭示
———浅谈神经科学现代研究方法
竺可青
(浙江大学基础医学院神经病理专业,浙江杭州310031)
摘要:神经科学研究是多学科、多层次的。神经科学的每一次飞跃几乎都与某种研究方法的出现有关。从形态学的束路追踪法、组织化学法、原位杂交法、其聚焦激光扫描显微镜,到生理学的脑内微透析术、脑片、微电泳及行为学方法;从电生理的电压钳、膜片和脑电波,到生物化学的层析法、放射免疫法、免疫印迹法等;从种类繁多的分子生物学方法到各种脑成像技术。每种新方法的出现都打开了一扇门,引入一个新领域。实践证明,人脑即使不能彻底了解人脑的奥秘,也可无限地逼近。

关键词:神经科学;电生理;分子生物学;脑成像

Can Human Brain Solve the Secreat of Human Brain
———Comment on Mordern Study of Neuroscience
ZHU Ke2qing
( Department of Neuro - Pathology , School of Medicine , Zhejiang University , Hangzhou 310031 , China)
Abstract :The main character of neuroscience study is multidiscipline and multilevel. Every progress in neuroscience is almost cor2 related with the advent of a new method. From morphology (such as tracing method ,histochemistry ,in situhybridization ,CLSM) to physiology (such as brain microdialysis , brain chip ,microelectrophoresis) ,from electrophysiology (voltage clamp ,patch clamp ,
electroencephalogram) to biochemistry (chromatography ,radioimmunoassay etc. ) ,from molecular biology to brain imaging ,every new method opens a new door and introduces a new field. The history confirms that even we can’t understand the secret of human brain throughly ,we will approach it infinitely.

Key Words :neuroscience ;electrophysiology ;molecular biology ;brain imaging
　　

     1989 年美国提出把1990 年1 月1 日开始的十年确定为“脑的十年”,标志着脑的研究受到全社会更大的重视,神经科学进入一个蓬勃发展的时期。神经科学的研究是多层次的综合研究,从研究思路上即是从分子到行为的一条龙研究。具体的研究方法则是以形态到机能,从一般生理学到电生理学,从常规生化到分子生物学,从手术下的观察到无创的活体脑成像技术。概括起来就是6 大方法,即形态学、生理学、电生理学、生化学、分子生物学和脑成像。这种排列顺序基本上反映了神经科学研究方法的进化历史。同时,在每一大方法中,也存在着多种研究方法的不断出现和发展。

1 　形态学方法
      神经科学的每一次飞跃都与某种研究方法的出现有关。每个新方法的出现都打开了一扇大门,引入一个新领域,促进神经科学的发展。形态学方法主要包括束路追踪法^{[1 ]} 、免疫组化^{[2 ]} 、原位杂交^{[3 ]} 、受体定位及神经系功能活动形态定位法。变性法是神经束路追踪法中历史最悠久并且延续至今的手段,利用神经元胞体受损或神经轴突离断后远侧轴突的变性,或轴突切断后细胞的反应,来研究纤维联系。20 世纪40 年代主要手段是镀银染色法,根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。20 世纪50 年代发展了Nanta 法,能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。但该法不易显示细纤维,1971 年Kristenson 等先后将辣根过氧化物酶(HRP) 用于追踪周围神经及中枢神经系的纤维联系,创造了HRP 追踪技术。1977 年Kuypers 将荧光染料法介绍于世。1984 年Gerfen 及Sawchenko 引入了PHA - L 法,1986 年Hornig 及Hume 介绍了神经元质膜荧光染色法DiI。通过数代科学家的不断努力,束路追踪法得以不断发展和完善。
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     20 世纪70 年代中期免疫组织化学蓬勃发展, 极大推动了整个医学发展,神经科学也受益匪浅。1969 年创建了原位杂交法,其灵敏度可达到显示细
胞内仅几个拷贝的mRNA 的程度。研究受体在神经系统内定位的受体定位法因此也发展为配体法、免疫组织化学法和原位杂交法三大类,而神经系统功能活动形态定位法则将功能学研究和形态学研究结合起来,进一步发展了神经科学的形态学研究。

2 　生理学方法
       应用生理学方法研究神经科学已有悠久历史, 种类繁多。传统的有脑髓横断、电流或化学法破坏中枢核团、电流刺激中枢核团、脑室灌流、鞘内注射、核团微量注射等。近年来,随着制造工艺更精湛,检测技术更完善,新的研究方法层出不穷。如测定神经递质释放量的有推挽灌( 1974) 、脑透析术(1985) 、脑片(1982) 、突触体(1962) [4 ]和抗体微探针(1988) ;定神经递质功能的有微电泳、抗体微量注射及生物测定;研究行为学方法的有经典条件反射和操作式条件反射。所有这一切事实都说明,研究方法学上的每一创新都使人们对神经系统的奥秘有深一步的了解。

3 　电生理学方法^{[5 ]}
       电生理学发源于1791 年。它基本上是随着电学仪器的进步而发展的。电流计的发明和应用于电生理学,初步满足了记录生物电活动的变化量小而变化速度快的特点。1922 年Erlanger 和Gasser 用了电子管放大器和阴极射线示线器,才彻底满足了记录生物电活动的基本特点。从此神经生理学得以迅猛发展。
       20 世纪40 年代以来,英国剑桥大学Hodgkin 学派利用微电极技术,而且选用了理想的实验标本枪乌贼的巨轴突,作出了划时代的成就。在修正了
Bernstein 膜学说的基础上,建立了动作电位的钠学说,阐明了神经冲动的传导理论。约在同一时期, Forbes 和Renshaw 等运用微电极开始了研究中枢神经系统神经元活动的工作。Hodgkin 等人为精确测量神经活动中的离子运动,发展了电压钳实验技术。在此基础上,Neher 又发展了膜片钳技术,为从分子水平了解生物膜离子单通道的开、关动力学,通透性和选择性提供了直接手段。为此Neher 获得1991 年诺贝尔医学或生理学奖。在电生理技术中脑电图和诱发电位的描记反映了脑细胞群体活动的总和性电位,在临床诊断方面具有重要价值。神经系统的电生理方法,对神经科学的理论发
展起着重要作用。而电生理技术的发展始终是和整个科学技术的发展分不开的。实际上只有在电生理与其他科学方法,如和形态学、神经化学、免疫技术等方法相结合,才有了今天神经科学的发展局面。

4 　生物化学方法
       神经科学中研究的生物分子无论是分子量、分子组成还是化学特性都千变万化。生物化学的各种研究方法正是分离、提纯和签定这些形式各异的分子的基本手段。经典的生物化学方法包括离心、电泳、层析、质谱等。由于生物化学方法与药理学、免疫学等其他学科相结合,又发展了放射免疫、放射受体和免疫印迹等方面。离心法是各种制备、鉴定方法的起始步骤,几乎没有一个实验没有离心法,也几乎没有一个实验仅用离心法就能完成。各种层析法是用来制备、鉴定和分离物质的主要手段,通常需将几种不同的层析法交替使用,才能达到预期的结果。由于HPLC 和FPLC 的使用,使分离的效率和分辨率大大提高。RIA 是用来检测生物体内低含量物质(如神经介质、激素) 的重要手段,也是对抗体进行检验的重要手段。RIA 主要用来分析研究受体的特性,也可用于测定某一受体的配体的含量及分析比较各种配体的作用强度。免疫印迹法结合了电泳及KIA 的优点,是鉴定蛋白质及肽类分子的理想方法。近年来从生物化学的方法中发展出了一门独立的学科及方法———分子生物学,它与前述几种方法
的结合极大地促进了神经科学的发展。

5 　分子生物学方法^{[6 ]}
       分子生物学是在分子水平上研究和解释生命现象的一门新学科。在20 世纪70 年代以前,由于缺乏对核酸分子的深刻认识及技术的贫乏,人们对神
经肽基因的研究受很大限制。近年来,随着分子生物学理论和技术的快速发展和不断完善,DNA 和RNA 成为较易研究的一类生物大分子,在序列分析和制造定点突变等方面,以核酸为对象的研究手段明显优于蛋白质为对象的研究手段。目前神经生物学研究中常用的分子生物学方法有:基因的分子克隆、克隆后基因的表达、克隆后基因作为探针研究基因表达的组织特异性和发育阶段特异性、研究基因转录调控区的结构特征有助于理
解基因转录调控机制、反义核酸研究等。PCR 技术自1985 年问世以来,已渗透到分子生物学各个领域,在神经科学研究中也有广泛用途。反向遗传学及遗传连锁分析法分离遗传病基因亦是当前研究的热点。转基因动物模型和体内基因替换等方法的出现不仅加速和深化了人们对神经肽结构和功能的认识,也为治疗人类遗传病提供了可能性。目前分子.生物学方法已成为神经科学研究方法的重要组成部分,被广泛用于神经系统发生、发育、分化和功能调节等生理及病理过程的研究。

6 　脑成像
       脑成像是指利用各种方法和技术来摄取人及动物颅骨及颅内组织结构的影像,从而了解s常的技术。如颅内X射线成像可清晰显示颅骨结构,脑血管造影可呈现血管床的来龙去脉,CT、核磁共振^[7]及正电子发射断层扫描术则可以更加清晰地提供各个不同层次颅骨及颅内组织结构的影像。脑成像术如今在科学研究及临床诊断上已成为了解颅骨及颅内组织结构异常的一种十分有用的手段。它几乎适用于各种头部疾患如骨折、炎症、占位性病变、损伤以及脑血管病变。毫无疑问,随着科学技术的不断提高,各种脑成像技术也将得到进一步发展和完善,使之在未来的科学研究和临床工作中发挥更大的作用。说到底,人脑毕竟不是受体基因、离子通道、骨架蛋白等等的机械堆集,而是生物界千百年进化发展而成的一台精美的机器。人脑的奥秘是否能由人脑自身来加以揭示,这是一个长期争论的哲学问题。但通过实践证明,回答是肯定的———即使不能彻底了解,也可无限地逼近。特别是近5～10 年来的进展,使我们加强了这方面的信心。例如,由于膜片钳技术的发展,使我们可知道一秒钟内有多少个离子
通过一个通道,帮助导致细胞的兴奋;由于分子遗传学的研究,使我们了解到基因上一个或几个碱基的突变可以引起一些“不治之症”,而基因疗法的诱人前景又为这些“不治之症”投来希望之光。由于PET 技术的发展,竟使我们能在屏幕上看到人脑思维行进的轨迹。20 年前,如果有人讨论这些,肯定会被认为是天方夜谭式的神话,而今天这一切已成为现实和常识。我们不妨设想,20 年后的神经科学又会向我们展示什么呢?

参考文献:
[1 ] 　HEIMER L ,ROBARDS MJ . Neuroanatomical Tract - tracing Methods
[M] . 2nd ed ,New York lenum,1990.
[2 ] 　蔡文琴,王伯云. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M] .
成都:四川科学技术出版社,1994.
[3 ] 　VALENTINO KL ,EBERWINEJ H ,BARCHASJ D. In situ hybridiza2
tion ,application to neurobiology[M] . Oxford :Oxford University Press ,
1987.
[4 ] 　WHITTAKER V P. Thirty years of synaptosome research[J ] . J Neuro2
cytol ,1993 ,22 :735 - 742.
[5 ] 　WALLIS D I. Electrophysiology - A practical approach [M] . Oxford :
Oxford University Press ,1995.
[6 ] 　卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M] . 北京:中国协和医科大
学出版社,1999.
[ 7 ] 　MOSELEYM E.Magnetic - resonance imaging of human brain function
[J ] . Surg Neurol ,1996 ,45 :385 - 391.
作者简介:竺可青(1968 - ) ,男,博士生,讲师,主要从事神经病理与
分子病理的实验研究。

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负标题比较合适，主标题有些过了。