求助

做了N次了，RT-PCR扩增产物均是预期的两倍长，且两个不同的指标都是这样 ，求救不知问题出在哪里？？！！

内参长度是正确的，条带肯定是特异性的，别人拿我的引物及反应体系做出来却是对的，真是百思不得其解，请高人指点，感激不尽！！！

［此帖子已被 bioguider 在 2005-6-13 14:55:05 编辑过］

我也再做rt 同样请教，rna提取后 可以看到明显的18s和28s，rna应该没问题。但是在扩完后，电泳10分钟是可以看见条带 （位置正确）但是比较微弱，电泳30分钟史就不见了，而且整个过程，在200bp左右始终可以看见很亮的带 不知道什么原因？谢谢

扩完后，?太不具体了,多大的带?什么条件的电泳,200bp左还是右

谢谢高手指点，我详细说一下吧，我扩的是大鼠pkcgamma的片断，结果是470bp左右，内参是gapdh，长度为290bp。
用的80v电压，也就是5v/cm，以前跑过10分钟，也可以分得开，但是不是很漂亮，所以就想多跑跑。
这种现象几乎每次都出现。昨天又重复了一遍，退火温度由原来的53度提高到55度，gapdh扩出，但还有dimer出现。gamma的dimer消失，但是条带仍然很弱，
分析：1。退火温度不合适，但不知该升还是降？
2.是否 gapdh引物设计不好，出现dimer?
3.关于rna 我认为还可以，因为用的qiagen的柱子提的，提完跑电泳，只有18s和28s条带，不知道这样认为对吗？谢谢高手

告诉你一个常规知识NA带负电望正极跑,而EB是望负极跑的,二者的方向正好相反,时间长了当然被DNA嵌入的EB含量就少了,在紫外灯下就看不见了;而且200bp左右的是引物二聚体,他们很亮说明已经把该泳道的EB几乎都吸附了,你的目的条带当然就比较弱了!如果EB含量足够高,那就是引物设计的不合理,二者之间的互补程度太高.建议更换引物,或者扩增电泳完毕后,单独用EB染色.如果用的是Taq酶就可按上述方法处理.如果是高保真的,告诉我什么酶,我告诉你怎么做.

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