活体动物生物发光成像技术

1．生物发光原理：
（1）生物发光原理：
将荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内，使荧光素酶得到持续表达。在体内，荧光素酶在ATP、氧气存在的条件下，与外源注入的特异底物反应产生发光现象。因此仅在活细胞内才会出现荧光，且荧光强度与标记细胞数目线性相关。
基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。标记细胞的方法基本上是通过分子生物学克隆技术, 将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选, 培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。目前, 常用的细胞株基本上都已标记好, 市场上已有销售。 将标记好的细胞注入小鼠体内后, 观测前需要注射荧光素酶的底物—荧光素，为约280道尔顿的小分子。荧光素脂溶性非常好, 很容易透过血脑屏障。注射一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30-45分钟。每次荧光素酶催化反应只产生一个光子，这是肉眼无法观察到的，精诺真公司（Xenogen Corp.）的IVIS成像系统，应用一个高度灵敏的制冷CCD相机及特别设计的成像暗箱和成像软件，可观测并记录到这些光子。

（2）技术原理：
体内透过光线的原理。光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用精诺真公司的IVIS系统最少可以看到皮下的500个细胞，当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。在相同的深度情况下, 检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系。可见光体内成像技术的基本原理在于光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器量化检测到的光强度，同时反映出细胞的数量。

2．生物发光成像系统组成：
以精诺真公司的IVIS100为例, 体内可见光成像系统主要由三部分组成——
（1）CCD镜头
选择适当的CCD镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。选用的CCD镜头对于波长大于600nm的光必须具有非常高的灵敏度和量子效率，而且由于需要探测的光源在皮下几厘米处，其噪声信号要尽可能的小。应用于生物发光检测的主要是电子记数加强型CCD镜头，它可以在噪音很低的情况下精确记数到单个光子。尽管如此，大部分此类型CCD的量子效率在450nm时仅有10%-15%, 在650nm时减小到低于1％。例如Hamamatsu公司的 C2400-30系列。有些CCD例如 iMultialkali 的S20在大于600nm时虽然有更高的量子效率，但其噪音很大并且其需要的冷却温度很低，难以实现。怎样减少电子记数型CCD的噪音和获得更高的量子效率是仪器研发者特别关注的技术难点，解决这个问题需要利用不同的光圈和滤光镜。
更为合适的CCD是制冷型的背照射CCD。 暗电流是CCD的噪音，在冷却到零下105摄氏度的条件下，暗电流降低到一个可以忽略不计的程度。以前的技术要达到零下105度的低温需要液氮冷却，现在有更好的低温设备可以方便的达到此温度。制冷型背照射CCD的信噪比可以达到要求，例如信噪比为10时，读数噪音和暗电流达到可以忽略不计的程度，并且量子效率也有非常好的表现。

（2）成像暗箱
成像暗箱屏蔽宇宙射线及一切光源，可以使暗箱内部保持完全黑暗，CCD所检测的光线完全由被检动物体内发出，避免外界环境的光污染。
CCD镜头位于暗箱的顶部，光线通过50毫米f1的光圈被CCD收集。镜头下部是滤光镜安装环，可以根据应用需要安装不同的滤光镜，扩展其光学成像能力。暗箱里的平台是由软件控制升降，通过升降可以获得不同的10厘米到25厘米视野（FOV），并且带有加热装置，可以保持观察试验动物的体温。

（3）软件系统
软件系统负责仪器控制和图像分析。软件控制镜头的焦距，曝光时间，滤光镜的更换，照明灯的开启，平台的升降，具有非常友好的用户界面，操作简便。如图6所示。

3．技术特性
相比较于目前的活体生物体内成像技术，如超声（Ultrasound）、计算机断层摄影（Computed Tomography ，CT）、核磁共振（Magnetic Resonance Imaging ，MRI）、正电子衍射成像（Positron-Emission Tomography，PET）、单光子衍射(Single-Photon-Emission Computed Tomography, SPECT)等技术，体内可见光成像技术(Optical Imaging)包括生物发光 （Bioluminescence） 与荧光（Fluorescence）具有许多独特的优点：操作简便，测量快速（短于5分钟），同时可检测多个动物，费用低廉等。


4．技术应用
通过活体动物体内成像系统，可以观测到疾病或癌症的发展进程以及药物治疗所产生的反应，并可用于病毒学研究、构建转基因动物模型、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究以及细胞体外检测等领域。具体应用如下：

（1）标记细胞
i. 癌症与抗癌药物研究[2]
直接快速地测量各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估。活体生物发光成像能够无创伤地定量检测小鼠整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤。精诺真生物成像技术提高了检测的灵敏度，即使微小的转移灶也能被检测到（可以检测到体内102个细胞的微转移）。目前已商品化的肿瘤细胞株包括：前列腺癌,黑色素瘤，乳腺癌，肺癌，子宫颈癌和结肠癌等 BiowareTM细胞系模型。

ii. 免疫学与干细胞研究[3]
将荧光素酶标记的造血干细胞移植入脾及骨髓，可用于实时观测活体动物体内干细胞造血过程的早期事件及动力学变化。有研究表明，应用带有生物发光标记基因的小鼠淋巴细胞，检测放射及化学药物治疗的效果，寻找在肿瘤骨髓转移及抗肿瘤免疫治疗中复杂的细胞机制。应用可见光活体成像原理标记细胞，建立动物模型，可有效的针对同一组动物进行连续的观察，节约动物样品数，同时能更快捷地得到免疫系统中病原的转移途径及抗性蛋白表达的改变。

iii. 细胞凋亡[4]
在正常生理条件下，细胞增殖和凋亡是严格协调的，这种平衡一旦打破，就会导致一系列的疾病，包括AIDS、神经退行性疾病、脊髓炎综合症、缺血/再灌注损伤及肿瘤等等。当荧光素酶与抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳动物细胞中表达，产生的融合蛋白无荧光素酶活性，细胞不能发光，而当细胞发生凋亡时，活化的caspase-3在特异识别位点切割去掉抑制蛋白，恢复荧光素酶活性，产生发光现象，由此可用于观察活体动物体内的细胞凋亡相关事件。

（2）标记病毒
i. 病毒侵染[5]
以荧光素酶基因标记的HSV-1病毒为例，可观察到HSV-1病毒对肝脏、肺、脾及淋巴结的侵和病毒从血液系统进入神经系统的过程。多种病毒已被荧光素酶标记，用于观察病毒对机体的侵染过程。

ii. 基因治疗[5]
基因治疗包括在体内将一个或多个感兴趣的基因及其产物安全而有效的传递到靶细胞。目前，基因治疗主要是以病毒做载体, 可应用荧光素酶基因作为报告基因用于载体的构建，观察目的基因是否能够在试验动物体内持续高效和组织特异性表达。这种非侵入方式具有容易准备、低毒性及轻微免疫反应的优点。荧光素酶基因也可以插入脂质体包裹的DNA分子中, 用来观察脂质体为载体的DNA运输和基因治疗情况。

（3）标记细菌
利用细菌荧光素酶基因可以分别标记革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。 常用的几十种细菌都已被标记, 用来进行细菌侵染和抗生素药物的研究。

i. 细菌侵染研究: 可以用标记好的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌侵染活体动物, 观测其在动物体内的繁殖部位、数量变化及对外界因素的反应。

ii. 抗生素药物:　利用标记好的细菌在动物体内对药物的反应，医药公司和研究机构可用这种成像技术进行药物筛选和临床前动物实验研究。近年来，国际上大型制药公司纷纷将精诺真技术在动物体内的实验结果作为ＦDA(美国食品和药品检验局)药物申报材料中非常重要的临床前动物实验部分。

（4）基因表达和蛋白质相互作用
i. 组织特异性基因表达： 荧光素酶(luciferase)是一类生物发光酶， 其中的renilla荧光素酶和firefly荧光素酶分别识别不同的底物, 一种细胞可被这两种荧光素酶标记: renilla 荧光素酶基因由一组成性稳定表达的启动子驱动, 作为内参，反应细胞数量的变化; firefly荧光素酶基因由要研究的组织特异性启动子驱动。这样firefly荧光素酶发光信号的变化，在消除细胞数量变化的影响后就可反应特定的启动子在动物体内的表达活性。

ii. 蛋白质相互作用[6]： 观察细胞中或活体动物体内两种蛋白质的相互作用，是将荧光素酶基因分成两段，分别连接所研究的两种蛋白之一的编码DNA，然后导入细胞或动物体内表达为融合蛋白。当两种蛋白有强相互作用时，表达的荧光素酶两部分相互靠近形成有活性的荧光素酶，在有底物存在时出现生物发光，反映出所研究的两种蛋白存在相互作用。应用此原理亦可用于研究细胞信号传导途径。

iii. 阻断RNA [7]：通过对比生物发光的变化，验证在成年小鼠体内，注射双链siRNA可以特异地阻遏基因表达。

（5）转基因动物模型
i. 基因表达[8]
为研究目的基因是在何时、何种刺激下表达，将荧光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型。利用其表达产生的荧光素酶与底物作用产生生物发光，反应目的基因的表达情况，从而实现对目的基因的研究。发育生物学方面可用于研究动物发育过程中特定基因的时空表达情况，药理学研究方面可观察药物诱导特定基因表达，以及其它生物学事件引起的相应基因表达或关闭。如图10所示。

ii. 各种疾病模型[9]
研究者根据研究目的，将靶基因、靶细胞、病毒及细菌进行荧光素酶标记，同时转入动物体内形成所需的疾病模型，包括肿瘤、免疫系统疾病、感染疾病等等。可提供靶基因在体内的实时表达和对候选药物的准确反应，还可以用来评估候选药物和其它化合物的毒性。为药物在疾病中的作用机制及效用提供研究方法。

5．发展前景：
活体生物发光成像技术是检测实验动物体内分子及细胞事件的强有力手段，正在被越来越广泛地应用于医学及生物学研究领域。相对于其他非侵入性观察手段，如PET等，生物发光成像技术以其极高的检测灵敏度及低廉的实验费用，可以在极短的时间内应用尽可能少的动物数精确得到预期的实验结果，为研究者提供了广阔的应用空间。通过对感染过程的观察，可以实时地提供关于疾病过程的新信息，或发现前所未知的新致病点。将这种高灵敏度、高精确性的观察方法与结构成像（如CT）相结合，是该项技术的一个发展方向，将会在观测到结构信息的同时，获得功能性信息。另外，还可以利用计算机控制的扫描激光将不同光线投射到动物体表，这些光线投射后发生偏转，从而度量动物体表各处的高度。由数码相机成像，用活体成像软件汇总影像信息，从而得出动物体表的拓扑信息。这些信息可用于对动物体表三维拓扑图像的重组。随着小鼠及人类基因组图谱的绘制完成，可以应用生物发光为信号，在转基因鼠体内研究特定基因的表达情况，从而了解其功能。因此，生物发光成像技术推进了人们对各种生命活动、疾病过程等深入认识。随着研究的发展，可见光体内成像技术将不仅用于基础科学研究领域，也将会作为新技术用于临床实践，扩展到临床检验及药物治疗领域，服务于人类的医疗卫生事业。

 

［此帖子已被 longmed 在 2005-10-26 17:54:32 编辑过］