内源性神经干细胞与脑缺血后的神经再生

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内源性神经干细胞与脑缺血后的神经再生



陈虎 蔡定芳



作者单位：200040 上海，复旦大学附属中山医院中医科


    摘要 神经干细胞具有分化潜能并可自我更新。近年来的研究发现，成人脑内也有神经干细胞，并且脑缺血后内源性的神经干细胞可以增殖分化，具有再生潜能。文章介绍了神经干细胞在成人脑内的分布和脑缺血后神经干细胞的自身激活及其可能机制，阐明内源性神经干细胞在脑缺血中的作用和可能的应用价值。
    关键词 神经干细胞；脑缺血；神经再生
    脑缺血是临床上常见的急性脑血管疾病，致残率和致死率均较高。治疗的关键在于挽救缺血半暗带濒临死亡的神经元和促进损伤后神经功能的恢复。虽然超早期溶栓和急性期神经元保护取得了重要进展，但对于大多数脑缺血患者而言，神经元死亡不可避免，如何积极有效地促进脑缺血恢复期神经功能的恢复仍然是目前脑缺血研究的重点。
    神经干细胞是指神经系统中具有多分化潜能，能够分化成神经元和胶质细胞并能自我更新的细胞，又称为神经前体细胞。神经祖细胞是干细胞分化的下一级细胞，分化能力有限。国内一般将神经干细胞和神经祖细胞统称为神经干细胞。自我更新和分化潜能是神经干细胞的两大特性。近年来，国内外开始研究神经干细胞移植对脑缺血的治疗作用，并已经取得了较大进展，但此项技术应用于临床仍有较大难度，主要是在技术和伦理学方面还有许多问题尚未解决。目前，国外学者正致力于研究其他干细胞，如造血干细胞或骨髓干细胞对脑缺血的治疗作用，以解决移植干细胞的来源问题。

1 神经干细胞在成人脑内的分布
    胚胎脑的许多部位，如大脑皮质、纹状体和小脑存在着具有分化潜能的干细胞，在发育过程中这些干细胞可分化成神经元和胶质细胞，逐渐形成有功能的中枢神经系统。越来越多的证据表明，成人脑内也存在着具有自身分化增殖能力的神经干细胞。这修正了人们的传统观念：成人脑内没有可以分化的干细胞，人脑内的神经细胞是永生性的，失去的神经细胞只能由胶质细胞眯填充。海马齿状回（DG）和侧脑室下区（SVZ）是成人大脑内源性的神经干细胞存在的2个主要脑区，DG的神经干细胞主要参与海马的再生，SVZ的新生细胞则与嗅神经的再生有关。但是，近年来关于SVZ是否是内源性神经干细胞的来源一直存在争论。Johansson等[1]认为，SVZ包括3种细胞类型，即星形细胞、快速增殖细胞和未成熟的神经元，但实际上SVZ只起到暂时停留和保存前体细胞的作用，而内源性神经干细胞的真正来源是室管膜细胞。Chiasson等[2]则发现，虽然培养的室管膜细胞可以增殖，但是缺乏自我更新能力，且只能分化成神经胶质细胞，而室管膜下层的细胞则具有神经干细胞的自我更新和多潜能分化特性，可以分化成神经元。关于内源性神经干细胞来源的具体部位尚有争论，然而侧脑室附近区域存在神经干细胞已被公认。
    除上述脑区外，成年脊髓和大脑皮质也存在着神经干细胞。从脊髓分离的细胞与营养因子共培养时，具有自我更新特性并可分化形成神经元、星形细胞和少突胶质细胞[3]。Mehler等[4]在出生后的哺乳动物大脑皮质内也分离出神经干细胞，认为对大脑的发育起重要作用。成年脑内广泛存在着神经干细胞，提示它们可能在出生后脑的再生、修复中起着重要作用。

2 脑缺血后内源性神经干细胞的自身激活及其机制

2.1 内源性神经干细胞的自身激活
    近年来的研究发现，脑缺血后自身的神经干细胞也可增殖分化，说明神经干细胞可参与脑缺血的生理病理过程。Kee等[5]采用两血管闭塞合并低血压法造成大鼠脑缺血模型，缺血再灌注1周后，齿状回干细胞的增殖增加了2~3倍；再灌注2周后，有60%的增殖细胞表达幼稚神经元的标记物CRMP-4；再灌注5周后，有36%的增殖细胞转化成成熟神经元。Jin等[6]发现，脑缺血不但可以促使海马齿状回的神经干细胞增殖，也可以影响SVZ的神经干细胞，而且未缺血侧大脑半球神经干细胞的增殖也有增加，其中缺血侧DG的神经干细胞增殖最明显。但是Zhang等[7]却认为，大脑中动脉闭塞造成的脑缺血仅能影响SVZ，不能促进DG细胞的增殖，细胞增殖的标记物BrdU在大脑皮质也有表达，主要分布在缺血灶周围。SVZ的细胞增殖在再灌注后第7天达到高峰，再灌注后14 d，增殖的神经干细胞总数达到最大值。
    以上实验结果的不一致可能与采用的缺血模型不同，造成的缺血性损伤部位不同，以及缺血时间不一，损伤程度存在差异有关。Arvidsson等[8]比较了大脑中动脉闭塞（MCAO）30 min和2 h对DG神经干细胞的影响，结果显示，脑缺血30 min仅能引起轻度的而且是可变的干细胞增殖，脑缺血2 h则能使DG神经干细胞明显增殖，而且这种增殖的增加并不依赖于海马神经元的死亡，与大脑皮质的损伤程度也无关。但是，缺血与干细胞之间并不完全呈直线关系，严重的缺血有可能导致干细胞减少。Levison等[9]用大鼠缺血缺氧模型证实，损伤4 h后SVZ有20%的细胞死亡；随着时间的推移，大量细胞出现凋亡，其中许多是小胶质细胞；缺血缺氧后3周，SVZ神经细胞数量较少，星形细胞增多，神经干细胞仅为正常时的1/4。
    近年来又有人发现，脑缺血不仅可以激活SVZ区和DG的神经干细胞，而且可以使缺血灶周围的某些成熟细胞逆转为神经干细胞。巢蛋白（nestin）是神经干细胞的特异性标记蛋白。它在干细胞中短暂表达，干细胞分化后这种特异性标记随之消失。Li等[10]的实验表明，MCAO后6~12 h，缺血灶中心处的星形细胞开始表达巢蛋白，随着时间的推移，缺血灶及周边区小胶质细胞、单核细胞也表达巢蛋白，其中以星形细胞表达最多，并延续到缺血后4周。更为有趣的是，缺血灶附近的一些神经元也呈现巢蛋白阳性。显然，这些巢蛋白阳性神经干细胞并非来源于SVZ和DG，因为它们具有成熟神经元和胶质细胞的特征，提示这种逆向转化的存在。

2.2 脑缺血后的神经再生
    Iwai等[11]认为，脑缺血后的神经再生可以分为增殖、迁移和分化3个阶段。沙土鼠脑缺血后第10天细胞增殖达到高峰；缺血后20 d开始增殖的细胞表达神经黏附分子（NCAM，一种参与神经细胞黏附和轴突生长，并可能促进突触可塑性的糖蛋白）并从颗粒层下区迁移入颗粒层；但直到缺血后60 d这些迁移的细胞才分化为成熟神经元。作者还发现，沙土鼠脑缺血后DG仅有少量星形细胞发生增殖，但不表达NCAM，同时还检测到NCAM阳性细胞与星形细胞之间存在着突触联系。Sato等[12]观察到，正常大鼠SVZ只有少量NCAM表达，且老龄动物较青年组略多。缺血90 min后，青年组动物NCAM阳性细胞数目增加，1 d后达到高峰，而老龄组动物在3 d后NCAM表达最多。这说明，脑缺血可以促进神经干细胞迁移，而且年龄因素对神经干细胞也有影响，再次提示调控神经干细胞因素的复杂性。
    突触素-1是突触小泡表面的一种磷蛋白，参与调节神经递质的释放、轴突的生长和突触的成熟。Marti等[13]发现，沙土鼠短暂性缺血后2、4和7 d，在海马齿状回的颗粒细胞层突触素-1的表达明显增加，但是与突触素相对应的突触体素没有变化，说明脑缺血选择性的作用于突触素-1，可能与突触的可塑性有关。

2.3 机制研究
    大量的研究已经证实了脑缺血可以激活成年大脑内源性神经干细胞，目前研究者渴望了解神经干细胞的调控机制以及如何用于卒中患者。神经干细胞的调控机制非常复杂，至今仍未完全明了。年龄、饮食、运动[12,14-15]以及信号转导通路和神经营养因子等都参与其中。脑缺血后神经干细胞的调控机制与正常时有所差异。
    兴奋性氨基酸毒性、炎症和凋亡是脑缺血过程中的重要病理生理过程。它们不仅能引起脑缺血后组织损伤，而且在一定的损伤范围内还激活机体的保护机制，促进神经干细胞的增殖，使机体有自我修复的可能。

2.3.1 兴奋性氨基酸
    兴奋性氨基酸途径参与神经干细胞增殖分化，但在正常状态下与脑缺血时对神经干细胞的作用相反。Arvidsson等[8]发现，兴奋性氨基酸受体拮抗剂MK-801可以完全阻断缺血2 h引起的干细胞增殖，提示兴奋性氨基酸途径在神经干细胞增殖中的重要性。大脑皮质去极化也可引起同侧大脑皮质星形细胞表达巢蛋白，MK-801则能阻止巢蛋白表达[16]。Bernabeu等[17]则发现，NMDA受体拮抗剂MK-801或AMPA受体拮抗剂NBQX可使正常动物DG增殖的细胞增加30%~90%，提示抑制兴奋性氨基酸受体活性可激发正常动物脑内干细胞的增殖。但是对于脑缺血动物，MK801和NBQX的作用则相反。缺血后立刻给予MK801或NBQX可阻断缺血本身引起的DG神经干细胞增殖；如果缺血再灌注7 d后给予MK801或NBQX，则对神经干细胞的增殖没有影响。不仅如此，MK801或NBQX还能抑制脑缺血后海马CA3区突触素-1的表达，说明二者对新的突触形成也有阻断作用，抑制了新生细胞的分化成熟。Nacher等[18]也证实，NMDA受体拮抗剂CGP43478单次腹腔注射后2~7 d，齿状回增殖细胞明显增多，同时可见巢蛋白阳性的放射状胶质细胞和NCAM阳性的颗粒细胞，说明NMDA受体拮抗剂不仅促进了正常齿状回干细胞的增殖，而且对其迁移和神经再生也有影响。

2.3.2 炎症与凋亡
     炎症机制对缺血后的神经再生也有影响。有实验发现，乙酰水杨酸可以减少脑缺血后神经干细胞的增殖[19]。由于乙酰水杨酸是环氧合酶的非特异性受体，从而表明环氧合酶和前列腺素在神经细胞的增殖中可能发挥重要作用。凋亡也可能在神经再生中发挥作用。Ekdahl等[20]发现，caspase通路的抑制剂可降低海马齿状核凋亡的发生，同时可以增加该区增殖细胞的数量。
     可以肯定的是，内源性神经干细胞的激活并不是脑缺血的直接结果，而是缺血引起了脑内某些因子的变化，通过不同途径作用于神经干细胞引起了增殖、迁移和分化的改变。首先，神经再生一般都是在脑缺血后1周左右开始的；其次，局灶性脑缺血不仅可以使同侧神经干细胞增殖分化，而且对对侧神经干细胞也有作用。Takasawa等[21]的实验结果表明，脑缺血后缺血对侧大脑半球DG的细胞增殖增加了6倍，其中80%是神经干细胞，10%是星形细胞。
     综上所述，神经干细胞具有分化潜能和自我更新的特性，如同一个天然的原料库，产生新的神经元，可参与修复缺损的神经功能。这也是众多学者热衷于研究神经干细胞的原因之一。神经干细胞用于治疗脑缺血主要有两个途径：（1）激活自身干细胞。通过某些手段放大其治疗作用，达到自身修复的目的。这种方法解决了干细胞的来源问题，不存在伦理学争论和免疫排斥反应，但其作用能否达到治疗的要求，需要进一步的探讨。（2）神经干细胞移植治疗脑缺血。虽然这样可以取得大量的干细胞，但来源困难，应使用其他部位的干细胞代替神经干细胞。还应注意的是，干细胞的增殖分化等受诸多因素的影响，我们至今尚未完全明了。获取尽可能多的有功能的新生神经元是我们的目的，但如何控制干细胞，特别是干细胞的定向增殖分化和迁移，仍然是尚未解决的难题。同时，即使上述障碍已经清除，新生细胞能否完全代替失去的神经元，重建正常的功能，仍不清楚。这迫切需要我们对神经干细胞的生理、功能、影响因素以及在脑缺血中的确切作用进行深入的研究。



参 考 文 献



1 Johansson CB, Momma S, Clarke DL, et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell, 1999, 96（1）: 25-34.

2 Chiasson BJ, Tropepe V, Morshead CM. van der Kooy D Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J Neurosci, 1999, 19（11）: 4462-4471.

3 Shihabuddin LS, Horner PJ, Ray J, et al. Adult spinal cord stem cells generate neurons after transplantation in the adult dentate gyrus. J Neurosci, 2000, 20（23）: 8727-8735.

4 Mehler MF, Gokhan S. Postnatal cerebral cortical multipotent progenitors: regulatory mechanisms and potential role in the development of novel neural regenerative strategies. Brain Pathol, 1999, 9（3）: 515-526.

5 Kee NJ, Preston E, Wojtowicz JM. Enhanced neurogenesis after transient global ischemia in the dentate gyrus of the rat. Exp Brain Res, 2001,136（3）: 313-320.

6 Jin K, Minami M, Lan JQ, et al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98（8）: 4710-4715.

7 Zhang RL, Zhang ZG, Zhang L, et al. Proliferation and differentiation of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone in the adult rat after focal cerebral ischemia. Neuroscience, 2001,105（1）: 33-41.

8 Arvidsson A, Kokaia Z, Lindvall O. N-methyl-D-aspartate receptor-mediated increase of neurogenesis in adult rat dentate gyrus following stroke. Eur J Neurosci, 2001, 14（1）: 10-18.

9 Levison SW, Rothstein RP, Romanko MJ, et al. Hypoxia/ischemia depletes the rat perinatal subventricular zone of oligodendrocyte progenitors and neural stem cells. Dev Neurosci, 2001, 23（3）: 234-247.

10 Li Y, Chopp M. Temporal profile of nestin expression after focal cerebral ischemia in adult rat. Brain Res, 1999, 838（1-2）: 1-10.

11 Iwai M, Sato K, Omori N, et al. Three steps of neural stem cells development in gerbil dentate gyrus after transient ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 2002, 22（4）: 411-419.

12 Sato K, Hayashi T, Sasaki C, et al. Temporal and spatial differences of PSA-NCAM expression between young-adult and aged rats in normal and ischemic brains. Brain Res, 2001, 922（1）:135-139.?

13 Marti E, Ferrer I, Blasi J. Transient increase of synapsin-I immunoreactivity in the mossy fiber layer of the hippocampus after transient forebrain ischemia in the mongolian gerbil. Brain Res, 1999, 824（2）: 153-160.

14 Lee J, Duan W, Long JM, et al. Dietary restriction increases the number of newly generated neural cells, and induces BDNF expression, in the dentate gyrus of rats. J Mol Neurosci, 2000, 15（2）: 99-108.

15 Kempermann G, van-Praag H, Gage FH. Activity-dependent regulation of neuronal plasticity and self repair. Prog Brain Res, 2000, 127: 35-48.

16 Holmin S, von-Gertten C, Sandberg-Nordqvist AC, et al. Induction of astrocytic nestin expression by depolarization in rats. Neurosci Lett, 2001, 314（3）: 151-155.

17 Bernabeu R, Sharp FR. NMDA and AMPA/kainate glutamate receptors modulate dentate neurogenesis and CA3 synapsin-I in normal and ischemic hippocampus. J Cereb Blood Flow Metab, 2000, 20（12）: 1669-1680.

18 Nacher J, Rosell DR, Alonso-Llosa G, et al. NMDA receptor antagonist treatment induces a long-lasting increase in the number of proliferating cells, PSA-NCAM-immunoreactive granule neurons and radial glia in the adult rat dentate gyrus. Eur J Neurosci, 2001, 13（3）: 512-520.

19 Kumihashi K, Uchida K, Miyazaki H, et al. Acetylsalicylic acid reduces ischemia-induced proliferation of dentate cells in gerbils. Neuroreport, 2001, 12（5）: 915-917.

20 Ekdahl CT, Mohapel P, Elmer E, et al. Caspase inhibitors increase short-term survival of progenitor-cell progeny in the adult rat dentate gyrus following status epilepticus. Eur J Neurosci, 2001, 14（6）: 937-945.

21 Takasawa K, Kitagawa K, Yagita Y, et al. Increased proliferation of neural progenitor cells but reduced survival of newborn cells in the contralateral hippocampus after focal cerebral ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab, 2002, 22（3）: 299-307