[求助]有关western的详细资料

谁有western的详细资料，给我发一份，谢谢阿

email:   xz_kang@126.com

我有一个protocol  挺好的 可以向我索取 becauseibelieve2000@yahoo.com.

我有，给你贴在这里吧。

Western blotting鉴定蛋白fficeffice" />

1、  安装电泳仪玻璃板;

2、  配制8%分离胶溶液,在两玻璃板间灌注,留出灌注积层胶的空间,以三蒸水覆盖,37℃放置30分钟,到出覆盖液体,三蒸水冲洗顶部数次;

3、  灌注5%积层胶溶液,斜行插入干净的梳子;放置室温37℃ 30分钟,小心取出梳子,以三蒸水冲洗加样槽,将凝胶固定于电泳仪上;

4、  电泳槽加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液;

5、  将样品于沸水浴中加热5分钟后立即插入冰中冷却并点样,每个时相点加蛋白样品100ug(总体积20ul);

6、  电泳,积层胶电压60v,待染料前沿进入分离胶后,电压改为80v,直至溴酚蓝到达分离胶底部后关闭电源;时间约为2-3小时。

7、  加三蒸水900ml,10×转移缓冲液100ml浸泡硝酸纤维素滤膜30分钟;

8、  取下玻璃板盒凝胶,打开夹板,黑色朝下,依次放上海绵,Whatman 3mm滤纸,凝胶和硝酸纤维素滤膜,再依次放置滤纸、海绵,注意不能有气泡,然后安装于电泳槽中;

9、  按电压20v于冰盒中电转过夜;时间16-18小时。

10、丽春红染色，观察转移后蛋白条带的大体情况。而后以双蒸水洗去丽春红。蛋白条带出现后,室温下以TBST(pH7.6)漂洗滤膜10分钟,共5次；

11、室温下以封闭液(1%BSA+TBS)浸泡滤膜或以含5%脱脂奶粉的TBS/T封闭液，4℃封闭8小时或更长或过夜；

12、弃去封闭液,以TBS/T(pH7.6)漂洗滤膜10分钟,共5次；

13、室温下以第一抗体液(1%BSA+TBS,一抗1:400)浸泡滤膜,密闭封闭盒, 4℃孵育过夜12小时；

14、 回收一抗,置4℃冰箱保存,以TBST(pH7.6)漂洗滤膜10分钟,共5次；

15、 第二抗体液(5%牛奶 + TBS,二抗1:5000)浸泡滤膜，室温下摇床孵育1小时；

16、回收二抗,置4℃冰箱保存,以TBST(pH7.6)洗涤滤膜10分钟, 共5次；

17、Peroxide Reagent B(20×conc)          100ul

   LumiGlo  Reagent A(20×conc)        100ul

   三蒸水                             1800ul

   洗膜2分钟；

18、L室中压片1-2分钟,以显影液显影2-3秒钟,待蛋白条带出现后,迅速以清水漂洗后置入定影液中定影1-2小时

19、提前于暗室中准备好：剪切好的X-光片、显影液、定影液、自来水。

20、入实验室准备好：保鲜膜一块、胶布、显色方盒一个、小青霉素瓶一个、滤纸一块、PVDF膜、底片夹。

21、吸取发光试剂A、B液各50μl，再加入三蒸水900μl（或翻倍），于小瓶内混匀，倒入发光试剂盒中，将PVDF膜夹出，滤纸上吸干水渍，转膜面上放入发光方盒中，用吸头喷洒发光试剂于膜上，约2分钟。

22、取出PVDF膜，滤纸上拍干，用保鲜膜包裹，注意保持平展，勿留气泡，转移面向上，用胶布固定于底片夹上。

23、带镊子、剪刀、底片、底片夹进入暗室。关照明灯，开红灯。

24、将剪切好的X-光底片放于发光膜上，对应的切角作好标记，密封底片夹，曝光2-3分钟，视曝光情况自行掌握时间。显影液中显影2-3秒钟，满意后用自来水漂洗，于定影液中定影30分钟（或1-2小时），水中浸泡。

25、图像分析：X-片经Bio-Rad2000图像分析仪进行分析。以相应蛋白条带的平均光强度值（Mean Value Intensity）表示蛋白表达强度。

 

[系统提示]:
  .::本帖子因为[奖励]解决了楼主提出的问题被神经科学论坛管理员runma实行了：+5金钱 +5经验 的奖惩::.