[转贴]脑组织切片培养 的 战友进来聊聊咱们的心得体会，发表一下高

正在和曾经做过脑组织切片培养的战友：你们辛苦了，兄弟我接这个活个把月了，材料读了不少，但还是有诸多问题不解，例如，如何保持切片在一个无菌的外环境中？还有这篇经典的文献A simple method for organotypic cultures of nervous tissue我是遍插茱萸 找不到啊，真是愁死我咧，呵呵，各位战友请为小弟指点迷津，不胜感激，有什么脑组织切片培养的资料分享一下更是雪中送炭！在这里小弟先献上一份薄礼，是培养的大体步骤：（见笑)滤膜培养法
程序
1、  用海罗芬（巴比妥类易可）2ML麻醉小鼠（day 8-10 old, Spray Dawley ）1-2MIN，程度要深。
2、  用75%酒精喷撒小鼠全身，后用75%酒精擦拭小鼠头部。用大剪刀断头
3、  用刀片沿头部中线切口并暴露颅骨，用大剪刀去颈部肌肉并沿颅骨的中线从枕骨大孔到脑半球间沟剪开接着做两横向切口
4、  用镊子拨开颅骨：在脑和颅骨之间插入一匙形物并切断颅神经和嗅球取出大脑
5、  轻置脑于有盖培养皿中，培养皿中含1ML冰冻格氏平衡盐溶液，（格氏平衡盐溶液中补充放有6.5G/L葡萄糖和25mM HEPES）
6、  用手术刀在脑半球胼胝体沟上做两失状切。用大的匙形物轻轻地将大脑皮质和海马从丘脑和基底神经节上分离出来。
7、  用手术刀在海马沟水平做一切口，用小剪刀从底核中舀出海马，如果切割充分快速的话（<10MIN）分离出第二个海马连同第一个一起进行切片
8、  用一无菌宽口塑料移液管转递已经在切片机（McIllwain tissue chopper (Brinkman, Westbury, NJ).）上切好的海马组织片于聚酯薄膜上
9、  排列海马使颞末端与刀刃垂直
10、  快速切割，约每秒一下，横截面约400-500vm
11、  用一无菌宽口塑料移液管转递海马切片至35mm皿中，其中含冰冻格氏平衡盐溶液，用摇晃的办法或者用优质毛刷使切片分开，操作要细心因为切片易损坏，4度培养分开的切片一小时
12、  置切片于分析显微镜下选择even margins and clear, uniform, well-defined pyramidal cell layers的切片至于薄膜上biomembrane surface 0.4 vm,
13、  吸1ml培养液与六孔板的每一个孔
14、  用一无菌宽口塑料移液管转递1-3个切片到滤膜的表面用微吸管去掉多余的液体。把切片放于滤膜中心位置切片间距应大于两毫米
15、  35度湿度95%二氧化碳5%每3-5天完全置换SCM？？？？？？？？
16、  在试管中4-5天后用抗有丝分裂剂（100 nM 5’-flurodeoxyuridine, 100 nM cytosince arabinoside and 100nM uridine in SCM处理掉有丝分裂的细胞）重新在每孔中加1CM含新鲜SCM的培养液
17、  体外培养10-12天后检查培养状况以检查锥形细胞和颗粒细胞层的保存状况，Discard cultures that display selective neuronal loss of a hippocampal region 体外培养可达28天。
18、  组织培养液每两天更换一次

所需药品：
1、  海罗芬（巴比妥类易可）
2、  75%酒精
3、  酒精棉
4、  冰冻格氏平衡盐溶液
5、  6.5G/L葡萄糖
6、  HEPES？？？？？？？？？
7、  SCM？？？？？？？？？
8、  培养液（50% MEM, 25% Hank‘s balanced salt solution, 25% Horse serum, 2 mM L-glutamine, 10,000 IU/ml penicillin, and 10,000 _g/ml streptomycin, pH 7.4, all from Gibco, Eggenstein, Germany), and the humidified, 5% CO2-containing atmosphere of the incubator at 36.5°C.）
（50% MEM with Earle’s salts and Lglutamine, 25% HBSS, 25% horse serum with 6.5 mg/ l D-glucose, 20 mM HEPES, and 50 U/ml streptomycin–penicillin, pH 7.2)
8、35度湿度95%二氧化碳5%？？？？?如何形成这样一个无菌的环境？？
所需器械：
1、  喷洒酒精的装置
2、  大剪刀
3、  刀片
4、  镊子
5、  匙形物
6、  手术刀
7、  无菌宽口塑料移液管
8、  切片机
9、  聚酯薄膜？？？？？？
10、  35mm皿
11、  优质毛刷
12、  分析显微镜
13、  4度冰箱？？？？？外环境如何保证无菌？？？？？
14、  薄膜？？？？？？
15、  六孔板
16、  5ml吸管

多做，小心点就行了。好像污染的情况不是很多阿，我们实验室都是technician做的，几乎天天作，也没见有什么污染，就是个经验问题。