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基于电压敏感染料的心脏电活动的光学标测技术fficeffice" />

本文作者金妍姝女士，西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室，生命科学与技术学院生物医学工程研究所硕士生; 张镇西先生，博士、生命科学与技术学院副院长、教授、博士生导师。2004年12月1日收到。

关键词: 光学标测  电压敏感染料  膜电位  心脏电活动

心电信息是指采用多种手段和方法 来获得所有能够反映心脏电生理活动的图形及由此而提取出的各种参数。对心脏电位信号的标测是研究电生理的基础，对研究心律失常等疾病的发生机制和治疗有着重要意义。目前常用的标测方法有心外膜电位标测，CARTO三维电磁标测，多电极网篮状导管标测(Multielectrode Basket Catheter，MBC)，体表心电标测及光标测技术(Optical Mapping Technique)。其中CARTO三维电磁标测系统和多电极网篮状导管标测系统可以用于标测心内膜电位，剩下三种主要应用于心外膜标测。对心脏电位进行标测，可以得到相应的等时图。正常情况下，心脏节律由窦房结控制，按照一定的传导路径激动整个心脏。但是在病态情况下，传导顺序就会改变。通过心外膜标测中的光学标测技术研究心脏动作电位时程图，可以充分显示心肌细胞复极异质性，从此阐明严重心律失常、功能性折返、扭转性室速(Tdp)和纤颤等的机制，有助于抗心律失常药物的药理分析; 同时，研究电场对细胞的影响，膜局部极化与除颤电脉冲时激动波之间复杂的作用机制，研究室颤发生时螺旋波与外电场的相互作用，可以为电除颤的临床治疗提供指导性建议，为电击除颤机理、心脏起搏器或除颤器程控功能的设计等项研究提供新的研究手段。

基于电压敏感染料(Voltage-Sensitive Dyes，VSDs，一种能将膜电位变化转化成荧光信号变化的染料)的光学成像技术是继电学、磁学之后用于人体细胞、组织器官的一种无创检测技术，也是最早对神经元活动进行光学成像的方法之一。基础电生理测量的膜片钳技术(Patch Clamping)、微电极记录(Microelectrode Recording)、细胞外多位点标测(Extracellular Multisite Mapping)及光学标测技术不仅可以直接测量单细胞离子通道电流，也可以直接对未受损标本进行光学成像。但是，在这四种技术中，只有光学标测技术是“细胞分子电生理”研究中观测微观电兴奋传导(Microscopic Impulse Propa-gation)唯一的不接触不穿刺的工具。它不仅可以多位点、同步、无损地记录心肌细胞群的膜电位变化，测量细胞与细胞间的电传导，而且可以记录全心脏的电活动，并转化为细胞动作电位以及除极复极等时图、等势图和动作电位时程(APD)图等彩色的图像显示。此外，在心肌细胞膜电位动态光学成像的基础上融合其他成像技术，可以使心脏生理信息检测向三维图像可视化的方向发展。这一技术也可以用于“定量神经电生理学”和“脑功能成像”等领域的研究，为进一步研究人体生理、病理和临床医学诊断提供了一种新手段。

一  心脏电活动光学标测技术

1. 心脏电活动光学标测技术的原理

心脏电活动的光学标测技术是借助于电压敏感染料将心肌细胞膜电位的变化转化成光学信号进行记录的一种新的功能成像技术。近10年来，利用电压敏感染料的生物膜电位光学标测技术逐步发展起来，其原理是用电压敏感染料对记录细胞或组织进行染色，然后，用激励光(一般波长460~580nm)照射其表面，当其细胞膜电位受刺激而发生变化时，膜表面染料作为分子转换器(Molecular Transducer)追随膜电位变化在膜表面出现荧光或吸光度的变化(荧光信号波长在600~700nm)，荧光强度变化和用电极记录到的膜电位变化呈线性关系。之后采用光学滤光片滤除激励光，记录膜表面荧光的变化，从而将生物电信号转换为光学信号记录并成像，可作为研究细胞电生理的基础手段之一。

2. 历史回顾

光学记录膜电位的方法始于1968年，由Cohen等人发现动作电位变化时伴随荧光和光折射等光学变化，首次提出了用光学信号记录膜电位变化。此后经过较长时间的探索日益发展成为一个实用性的膜电位记录方法。此技术对记录细胞无创伤性，而且具有高度的时间和空间分辨率，在随后的大量研究中证实光学信号变化和用电极记录到的膜电位变化呈线性关系。1994年，Schuette应用成像增强仪(Image Intensifier)和摄像管(Camera Tube)监测癫痫病发作时大脑皮层的荧光变化，这是第一次真正意义上用光学方法多位点同时记录膜电位。此后，在实际应用中，此技术涉及微弱光电信号的采集处理和研制及筛选适宜染料等难题，随着新型染料的合成和光学探测技术的发展，这一技术日益发展成为一个实用性的记录膜电位方法。

3. 心脏电活动光学标测技术的研究对象和优点

心脏电活动的光学标测研究对象具有三个层次，分别是对培养的心肌细胞(Cultured Cardiomyocytes)的微观脉冲传播的测量，无损心肌块标本(Intact Wedge Preparation)的跨壁标测及对整个心脏(Whole Heart)的光学标测。对心肌细胞的微观脉冲传播测量要求确定所研究组织的细胞结构，且测量系统的分辨率达到细胞或亚细胞水平，空间上必须小于细胞的尺度，时间上必须能追踪细胞内或者细胞间的激动传导延迟，所以要求时间分辨率应该达到1~ 10ms，空间分辨率小于单个细胞的大小(10mm)。跨膜电位绝对值的测定可用来研究心脏组织跨膜电位分布的空间异质性，研究“折返波”(产生严重心律失常)的跨壁传导过程或不同层的心肌细胞(心内膜或心外膜)受激传导过程。同时，可以用全心脏光学标测技术，测量心脏整个前表面(后表面)或局部区域的心电除极和复极过程。

和传统的微电极技术相比较，心脏电活动的光学标测具有以下优点: a.多位点同步记录(Simultaneous Measure-ment from Multiple Sites)可以同时测量多个细胞或从多侧面记录单个细胞的电活动，帮助人们了解生物膜离子通道开、关的动力学，细胞选择性和通透性，观测微观脉冲传播等过程; b.时间分辨率高(High Temporal Resolution)测量系统有微秒级的时间响应，最小可达到1ms，可以完成细胞间电传导方向、速度以及整个组织器官电活动的测量; c.空间分辨率高(High Spatial Resolution)，可达到10mm的空间分辨率，克服传统微电极阵列测量技术检测位点数目及测量尺度有限的缺陷; d.非介入性(Non-contact)测量过程采用空间分辨，对待测物无须接触、穿刺，为记录较小的神经细胞提供了可能性; e.广泛适用性(Broad Appli-cations)测量信号不会被其它大的外加电信号破坏，为研究外电场作用下的电生理机制提供了技术支持。

二  心脏电活动光学标测记录系统和功能图像

1. 光学标测记录系统

整个系统由光学记录系统以及微机控制系统组成。光学记录系统又分为光学激发系统以及光电转换系统，光学激发系统由光源、聚焦镜、滤光片、二向色镜(分色镜)组成，光电转换系统包括光纤、增幅系统和光电转换器件(高速CCD或者光电二极管阵列)以及电信号放大器件; 微机控制系统控制光学记录系统并采集和处理数据。同时利用测试平台来准确测量系统的时间分辨率和空间分辨率，利用微电极技术测量的膜电位变化来对光学标测系统做准确标定。

光源可采用100W高压汞灯(利用汞放电时产生的高气压，获得高的可见光发光效率的一种光源)或者其它光源(弧光灯或钨丝灯)作为激励光源。激励光经过扩束及平行(均匀照射目标组织)后，通过530~585nm干涉滤光片(是利用光的干涉有单色或带通的光谱透过特性的滤光器)滤波后投射到待检测组织(灌注过电压敏感染料)上，激励后的荧光信号又经过透镜聚焦、干涉滤光片(>615nm)滤波和光学倍增器放大后，由光电转换器件转换成电信号，电信号经过放大后由计算机采集并处理。在本系统中，可利用600nm的二向色镜(也可叫分色镜或者半反半透镜)达到荧光信号与激励光的有效分离。单光源实验用系统原理图如图1所示。

 

原始(激励光反射)光学信号经过分光镜后由另一路光电转换器件转换成电信号，与记录的荧光电信号进行对比修正，可以有效提高信噪比和系统准确度。在心脏电活动的光学标测技术中; 结合钙敏感染料(一种将细胞钙离子浓度变化转化为荧光信号变化的染料)可研究心脏电活动的离子作用机理。用此双指示器技术可同时测量膜电位变化和钙瞬变，有助于了解早期后除极(Early After Depolarization，EAD)在几个细胞水平上的时空形式。同时灌注钙敏感染料和电压敏感染料的样品需要双光源激励，而图像也需要同步采集，双光路转换可以满足这种要求。双光源试验用系统原理图如图2所示。fficeffice" />

2. 心脏电活动的光学标测技术所得到的功能图像

光学标测技术采用光学滤波片滤除激励光，记录膜表面荧光的变化，从而将生物电信号转换为光学信号记录并成像，可作为研究细胞电生理的基础。根据电压敏感染料发射荧光随跨膜电位的变化引起的荧光变化的dF/F(膜电位变化时荧光强度的变化量与背景荧光强度的比值)确定细胞的动作电位。除极、复极等时图、等势图和动作电位时程(APD)图是主要的功能图像，可以为研究者提供动作电位时空的动态传导图。每一象素(或位点)的光强变化(与膜电位变化呈线性关系)可通过数据处理或图像处理以灰度梯度或彩色梯度显示; 也就是说，灰度梯度图和彩色梯度图通过光强变化来间接地描述每一个象素(或位点)的膜电位变化。如图3所示。其中，上图为在左下图所示区域的8个点，用单相电击心外膜时所记录到的动作电位时程图，左下图标出了所标测的8个点，右下左图为电击后的跨膜极化等势图，右图为电击后兴奋后的等时图。

三  研究状况

1. 电压敏感染料和探测设备的发展状况

电压敏感染料也称为膜分子探针或荧光探针，已研制出的染料种类多达2000多种。按照染料对膜电位变化的反应速度可以分为慢反应电压敏感染料(Slow Voltage-Sensitive Dyes)和快反应电压敏感染料(Fast Voltage-Sensitive Dyes)，其反应机理有所不同，目前快反应电压敏感染料应用更广。由于心电传导速度高，只能采用快反应电压敏感染料。基于荧光变化的dF/F(为优化信噪比，要求有尽可能高的dF/F)、染料的内在化(Internalization)、光毒性(di-8-ANEPPS的光学毒性作用很小，甚至可以忽略不计)这些因素的考虑，快反应电压敏感染料di-8-ANEPPS最适于培养心肌细胞跨膜电位的记录。

在心脏电活动的光学标测技术中，光电探测器主要有光电二极管阵列(PDA)、CCD和光电倍增管。PDA和CCD用于跨膜电位变化空间形式的光记录，而光电倍增管用于记录共焦或随机存取扫描系统中荧光强度的变化。选择光电探测器应考虑到它们的空间分辨率，量子效率QE，暗噪声和反应速率。CCD具有相对较好的空间分辨率，而PDA系统则具有较好的时间分辨率。早期的PDA多为10×10阵列，现已出现128×128阵列。高速Cooled CCD具有更好的时空分辨率。

2. 研究状况

利用光学方法检测生物电信号的研究在国内几乎没有开展。仅有的工作是胡德文等人于2001年对基于电压敏感染料的大脑本征信号光学功能成像技术做的概述性报道; 以及杨仕明等人在2002年在对低级听觉中枢及前庭通路研究中，用光学记录方法观察了细胞群的电生理信号，认为此方法可行。利用光学标测技术在心脏电生理研究方面未见国内报道。而在国外，尤其在美国，有哥伦比亚大学(Columbia University)、杜克大学(Duke University)、北卡罗莱纳大学(University of North Carolina)和西部储备大学(Case Western Reserve University)等开展了光学标测技术在心脏电生理方面的研究; 除此之外，日本东京大学(University of Tokyo)和瑞士波恩大学(University of Bern)也开展了此项研究，取得了许多意义重大的研究成果。

四  结语

基于电压敏感染料的光学标测技术除了应用于心脏电活动的测量之外，还可以被广泛应用于电生理学研究的各个领域，包括中枢神经系统、骨骼肌细胞、心肌细胞、红细胞及外分泌腺体等。由于其所具有的高时空分辨率的特点，所以很适合于大脑皮层结构与功能关系的研究。可以预测，随着电压敏感染料和光学成像技术的发展，凡是具有膜电位变化的活体细胞、组织器官，都可以借助于该方法进行相关研究，从而可以克服传统检测手段带来的一系列问题。利用电压敏感染料的光学成像技术通过精确记录膜电位的变化，还可以帮助人们间接地研究其他生理机能，比如L-赖氨酸在肠中的转移、阴离子在膜内外的交换、线粒体的呼吸作用等。同时，将光学标测技术与传统电生理测量技术(如微电极、膜片钳)及荧光测钙技术相结合，将形成一个更加完备的生理学研究方法，在未来的定量心脏电生理研究中有着广阔的发展前景，可以为进一步研究人体生理、病理和临床医学诊断提供一种新的技术支持。(本课题为国家自然科学基金资助项目，批准号: 60378018)

 

来源：《世界医疗器械》

出版日期：2005年2月

 

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