神经干细胞如何传代？

我是做新生大鼠神经干细胞培养的，我的培养基是DMEM/F12(1:1),B27,bFGF20ng/ml,EGF20ng/ml,肝素5微克每毫升，5天左右能形成较小的神经球。我一般3天换液，9-10天传代。换液采取全量离心换液，传代则机械吹打或胰酶加胶原酶消化。但是传代时总是不能把神经球完全打开，它似乎太紧密了。而且我传代后，所看见的大量神经球似乎是打开的单个细胞重新聚集所形成的聚集体，而不是细胞增殖所得到的神经球。我没有观察到明显的细胞增殖现象，而且我的单细胞克隆总是没有成功。我想请教各位老师，我的培养方法有没有什么错误。另外有什么传代和做单细胞克隆的好方法？
     还有一个问题：原代时细胞密度最好种多大？  

新生大鼠神经干细胞已经较少，可以采用胎鼠。我的培养基是DMEM/F12(1:1),B27（2ml0,bFGF20ng/ml,EGF20ng/ml,，5天左右能形成较小的神经球。我一般5-7天传代，不换液，传代时流2ml旧的培养液，传代则机械吹打不能用胰酶加胶原酶消化。第一二代可以得到单细胞，不能把神经球完全打开，也没有关系的。可以观察到明显的细胞增殖现象。单细胞克隆最好选二代，换液第2天，吹打时缓忙用力，保证细胞活力最好。原代时细胞密度最好种5000-10000/ml

我同意楼上大虾的意见，传代有两个关键：1.传代的时机，在细胞活力最好且需传时传；2.不用酶消化，机械吹打要轻柔，不必求全打散！

我同意楼上大虾的意见，传代有两个关键：1.传代的时机，在细胞活力最好且需传时传；2.不用酶消化，机械吹打要轻柔，不必求全打散！
我做的是小鼠胚胎神经干，我认为原代密度以３＊１０５为好！