神经细胞培养（转帖）

一． 设备： 无菌操作设备。



二． 大型设备CO2培养箱：恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值。



倒置显微镜：用于每天观察贴壁细胞生长情况。



解剖显微镜，用于准确地取材。



常温冰箱：-4℃，用于保存各种培养液，解剖液和鼠尾胶。



低温冰箱：-20℃--80℃，用于储存血清酶，贵重物品和试剂。



电热干烤箱：用于消毒玻璃器皿。



高压消毒锅：用于消毒培养皿，手术器械。



过滤器：配制解剖液、培养液，必须过滤后才可使用，以去除细菌。



渗透压仪，pH剂，天平等。



三． 培养器皿及手术器械



1 培养皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直径。



2 培养板，24-40孔，可用于开放培养。



3 培养瓶：



4 吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。



5 各类培养液贮存器。



6 小型手术器械。



准备：



一 配制培养液



（1） 解剖液：以无机盐（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS缓冲液，保持一定的渗透压和pH值。



（2） 基础培养基（MEM）：主要为多种氨基酸，加入葡萄糖，双蒸馏水溶解。



（3） 接种培养液：用于胰酶消化后的细胞分散，做成细胞悬液，其成分为MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%马血清，当天配制。



（4） 维持培养液：接种后24h，全部换成此液，后每2周换一次，每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清，1%谷氨酰胺，及适量的支持性营养物质。



二 培养基质 常用鼠尾胶、小牛皮胶，多聚赖氨酸，再涂胶



三消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗2-3d，达两次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包装，置于烤箱中干燥消毒，于培养前1天进行。



神经细胞分散培养



（一） 选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以20-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。



（二） 取材。脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养。



（三） 细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于培养皿（1×106），做电生理应为5×105或更低。



（四） 抑制胶质细胞生长。培养3-5d后，也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。



（五） 观察。接种6-12h，开始贴壁，并有集合现象，细胞生长突起明显，5-7d胶质细胞增生明显，7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面，形成地毯，2周时神经细胞生长最丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神经细胞开始退化，变形，甚至出现空泡，一般培养2-4周最宜。


           但神经细胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞周期，而且随培养时间的延长，细胞数量在下降，但胶质细胞可以，神经胶质细胞也可以。在培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经细胞死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多，且相互形成突触。



（六） 常用培养细胞实验有：FCM的蛋白总量分析；膜片钳与离子通道的分析；免疫组化分析；



但免疫组化分析应注意，由于抗体直接作用于活细胞，不易穿透活细胞，故对核内抗原定位时，首先考虑膜对抗体的通透性问题。常用化学试剂以增加其通透性或采用冰冻方法解决。



在免疫组化中，或其它组织学染色中，常用不同的染色方法以区分不同细胞，如半乳糖脑苷脂对小树突胶质细胞标记明显；GFAP对星形胶质细胞具有特异性染色等。这对研究神经系统中胶质细胞功能具有极大的应用价值。神经胶质细胞以往多被忽视，其在脑血管疾病（如缺血性损伤）、退行性疾病（如AD、PD）、损伤后胶质细胞的填充等具有不可忽视的作用。它也是神经细胞功能和营养支持的物质基础。　

好东东

ＰＬＬ包被的方法比较简单：
浓度：25－100mg/ml
温度：37度
时间：4h—overnight

之后用无菌水清洗3遍，晾干即可种入细胞。

赖斯太难看了

请问可以详细介绍细胞免疫组化中的包被方法（ＰＬＬ）吗？谢谢

[em18] PLL包被时这么高的浓度？我见过最高的仅1mg/ml,可以讨论一下哦

我们用50μg/ml，也挺好

好东东！
请问能介绍如何做海马神经元急性分离膜片钳记录的步骤吗？
新手急急急！！！
谢谢！！！

谢谢

不错!对我们神内的有帮助啊